MacConkey Agar

Indicação de uso

O MacConkey Agar é um meio seletivo utilizado principalmente para a detecção e isolamento de bactérias gram-negativas em amostras clínicas, lácteos, alimentos, água, farmacêuticas, cosméticos, entre outros segmentos industriais. Este meio é usado para isolar e diferenciar micro-organismos fermentadores de lactose de bacilos entéricos gram-negativos não fermentadores de lactose.

MacConkey Agar está em conformidade com as especificações dadas pelos métodos harmonizados de EP (Farmacopeia Europeia), USP (Farmacopeia Americana), JP (Farmacopeia Japonesa) e FB (Farmacopeia Brasileira) para Exame Microbiano de Produtos Não-Estéreis: Testes para Micro-organismos Especificados (Pesquisa de E. coli).

O meio MacConkey original foi usado para diferenciar cepas de Salmonella typhosa de membros do grupo coliforme. Modificações na fórmula melhoraram o crescimento da Shigella e cepas de Salmonella. Essas modificações incluíram a adição de cloreto de sódio a 0,5%, teor de ágar diminuído e concentrações de sais biliares e vermelho neutro alteradas. Essas melhorias na formulação resultaram em reações diferenciais melhoradas entre esses patógenos entéricos e o grupo coliforme.

MacConkey Agar contém cristal violeta e sais biliares que inibem o crescimento de organismos gram-positivos e permitem o crescimento de organismos gram-negativos. Colônias isoladas de bactérias do grupo coliforme apresentam coloração vermelha e podem estar rodeadas por uma zona de bílis precipitada (zona turva). Este precipitado de bile ocorre devido a uma queda de pH local em torno da colônia decorrente da fermentação de lactose. Colônias que não fermentam a lactose (como os bacilos tifoides, paratifóides e causadores de disenteria) permanecem incolores. Quando os não fermentadores de lactose crescem nas proximidades de coliformes, o meio circundante apresentam áreas limpas.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Hidrolisado de pancreático de gelatina – 17,0 g
• Peptona (carne ou caseína) - 3,0 g
• Lactose monoidratada - 10,0 g
• Cloreto de sódio - 5,0 g
• Bile de boi desidratada - 1,5 g
• Vermelho neutro - 30,0 mg
• Cristal violeta - 1,0 mg
• Agar - 13,5 g 

O pH final é 7.1 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

O hidrolisado de pancreático de gelatina e a peptona fornecem aminoácidos e outros fatores de crescimento. Sais biliares e cristal violeta inibem em grande parte o crescimento da microbiota gram-positiva. Lactose e o indicador de pH Vermelho neutro são usados para detectar a degradação da lactose. Bactérias fermentadoras de lactose baixam o pH do meio, de modo que há uma reação com o corante Vermelho neutro e as colônias crescem em tons de rosa a vermelho tijolo. Além disso, Escherichia coli e outras bactérias formadoras de ácido apresentam uma zona de sal biliar precipitado ao redor das colônias. Bactérias não fermentadoras de lactose crescem incolor ou apresentam colônias claras.

Ágar é o agente solidificante.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de colônias ou alteração de cor.

O micro-organismo citado pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Agar MacConkey de modo a verificar a seletividade é a cepa de Escherichia coli ATCC 8739.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio um pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa E. coli e coliformes totais. A produção de ácido faz com que a colônia fermentadora de lactose cresça com uma coloração de rosa a vermelho tijolo.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

MacConkey Broth

Indicação de uso

O MacConkey Broth, também conhecido como Caldo MacConkey é um meio de cultura seletivo utilizado como teste presuntivo para Escherichia coli e coliformes e para determinar a presença de Escherichia coli ou coliformes em amostras de leite, água e outros materiais de acordo com MacConkey e Hill (1901). Este meio está em conformidade com as especificações dadas pelos métodos harmonizados de EP, USP, JP para pesquisa de Coliformes Totais e E. coli em Produtos Não-Estéreis.

MacConkey Broth é uma modificação do caldo sal biliar original recomendado por Alfred MacConkey que continha 0,5% taurocolato de sódio e tornassol como indicador. Em publicações posteriores, MacConkey sugeriu variações desta formulação usando indicador vermelho neutro em vez de tornassol. Eileen Childs e L.A. Allen mostraram que algumas amostras de vermelho neutro exerceram efeito inibitório sobre o crescimento de Escherichia coli neste meio. O Púrpura de bromocresol é menos inibitório e a mudança de cor de púrpura para amarelo fornece uma indicação mais sensível e definida da formação de ácido. Oxgall (Bile bovina) no meio substitui o taurocolato de sódio original para inibir o crescimento de organismos gram-positivos.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Hidrolisado de pancreático de gelatina - 20,0 g
• Lactose monoidratada - 10,0 g
• Bile de boi desidratada - 5,0 g
• Púrpura de bromocresol - 10,0 mg 

O hidrolisado de pancreático de gelatina fornece aminoácidos e outros fatores de crescimento. Organismos que fermentam lactose crescem muito bem no Caldo MacConkey produzindo ácido, fazendo com que o meio fique amarelo devido à reação com o corante púrpura de bromocresol, que age como um indicador de pH. Também é produzido gás, que é coletado nos tubos de Durham em ensaios que utilizam a técnica de NMP (Número Mais Provável) com tubo invertido.

Os organismos não fermentadores apresentam um bom crescimento, mas não produzem ácidos ou gás.

A bile de boi promove o crescimento de várias espécies de bactérias intestinais e inibe a de micro-organismos, que não habitam o intestino, tais como bactérias gram positivas.

O pH final é 7.3 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver turvação ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Caldo MacConkey são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Escherichia coli ATCC 8739.

Para verificar a capacidade inibitória:

Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio um pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa E. coli e coliformes totais. A produção de ácido faz com que a cor do meio fique amarela em uma reação positiva, com produção de gás. Uma reação negativa resulta em nenhuma mudança de cor e o meio permanece púrpura.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Violet Red Bile Glucose Agar

Indicação de uso

O meio Violet Red Bile Glucose Agar, também conhecido como Crystal Violet Neutral Red Bile Glucose (Dextrose) agar e Ágar Violeta Vermelho Neutro Glicose é utilizado para a detecção e enumeração de Enterobacteriaceae em alimentos e ração animal e outros materiais. Também é listado na Farmacopeia Brasileira, United States Pharmacopeia (USP), European Pharmacopoeia (EP) e Japanese Pharmacopoeia (JP) como o meio sólido recomendado para uso no isolamento de bactérias gram-negativas bile tolerantes em produtos farmacêuticos não estéreis.

O grupo Enterobacteriaceae inclui bactérias fermentadoras de lactose, cepas não fermentadoras de lactose de E. coli, e espécies não fermentadoras de lactose, como Salmonella e Shigella. Ao examinar alguns alimentos, é desejável detectar Enterobacteriaceae em vez das bactérias do grupo coliformes.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Extrato de levedura - 3,0 g
• Digestivo Pancreático de Gelatina - 7,0 g
• Sais Biliares - 1,5 g
• Cloreto de sódio -5,0 g
• Glicose monoidratada -10,0 g
• Agar-15,0 g
• Vermelho neutro - 30,0 mg
• Cristal violeta - 2,0 mg 

Violet Red Bile Glucose Agar contém digestivo pancreático de gelatina como fonte de carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais. Extrato de levedura é um suplemento de vitaminas do complexo B que estimulam crescimento de bactérias. A glicose é um carboidrato. Sais biliares e cristal violeta inibem bactérias gram-positivas. A fermentação de glicose produz colônias vermelhas com halos vermelho-púrpura (precipitação biliar) na presença de vermelho neutro, um indicador de pH. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. Agar é o agente solidificante.

O pH final é 7.4 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. O meio deve ser aquecido com agitação frequente e fervido por não mais do que 2 minutos para dissolver completamente o pó. Este meio não deve ser autoclavado devido à presença de corante e bile.

Se o meio for utilizado imediatamente para a técnica de pour plate, deve ser resfriado a 44-47°C em banho-maria antes do uso. O meio fundido deve ser usado o mais rápido possível, não devendo ser retido por mais de 3 horas.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de colônias ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Violet Red Bile Glucose Agar são:

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027;

Escherichia coli ATCC 8739.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Obs.: Caso o analista queira testar a capacidade inibitória do meio frente a bactérias gram positivas, pode-se utilizar a cepa de Staphylococcus aureus ATCC 6538. Neste caso, após incubação, a placa deve apresentar nenhum ou pouquíssimo crescimento.

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo. Incubar Usando o método de pour plate, inocular e incubar a 35 ± 2°C durante 18-24 horas. Usando a técnica de estrias, inocular e incubar culturas a 30-35°C durante 18-24 horas. Enterobacteriaceae fermentam glicose, produzem ácidos formando colônias de vermelho a roxo escuro rodeadas de halos vermelho-púrpura. Certas Enterobacteriaceae podem causar descoloração de suas colônias ou do meio. Portanto, quando nenhuma colônia característica está presente, escolha colônias esbranquiçadas para confirmação.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010