O m Endo Agar Les, também conhecido como Endo ágar, Endo ágar LES (Lawrence Experimental Station formulation) é um meio seletivo utilizado para pesquisa de coliformes na água por filtração em membrana, citado na USP no capitulo 〈1231〉 WATER FOR PHARMACEUTICAL PURPOSES que por sua vez sugere o Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater como métodos microbiológicos de análise em água e também citado como opção de meio em pesquisa de coliformes em água na Farmacopeia Brasileira.
McCarthy, Delaney e Grasso formularam Endo Agar LES (Estação Experimental de Lawrence) para teste de coliformes em água bactérias por um procedimento de filtração em membrana de duas etapas usando Lauryl Tryptose Broth como enriquecimento preliminar. Ele recuperou um maior número de coliformes por este método em comparação com a técnica de uma etapa usando m Endo Broth. A American Public Health Association especifica o uso de m Endo Agar LES na filtração por membrana de coliformes totais como padrão procedimento para testar água potável e água engarrafada. É também especificado para uso na fase concluída da norma técnica de fermentação total de coliformes
Logo após a publicação de Holt-Harris e Teague em um artigo que descreve um novo meio de cultura para a diferenciação de micro-organismos entéricos através do uso de eosina e corantes de azul de metileno, Levine descreveu uma modificação de sua formulação, que ele afirma ter dado melhor diferenciação entre o que agora é conhecido como Escherichia e Enterobacter espécie. As duas formulações diferem em que Levine EMB Agar não contém sacarose. Ambas as formulações foram desenvolvidas para melhorar as propriedades diferenciadoras de Endo Agar, que foi desenvolvido anteriormente.
Formulação e Preparo
- Extrato de levedura - 1,2 g
- Casitone - 3,7 g
- Tiopeptona - 3,7 g
- Tryptose - 7,5 g
- Lactose - 9,4 g
- Fosfato dipotássico - 3,3 g
- Fosfato Monopotássico - 1,0 g
- Cloreto de Sódio - 3,7 g
- Desoxicolato de sódio - 0,1 g
- Lauril Sulfato de Sódio - 0,05 g
- Sulfito de sódio - 1,6 g
- Fucsina básica - 0,8 g
- Agar - 15,0 g
Reidrate o produto em 1 L de água contendo 20 mL de etanol a 95%. Aquecer com agitação frequente e ferver durante 1 minuto para dissolver completamente o pó. NÃO AUTOCLAVE
O pH 7,2 ± 0,2
CUIDADO: A fucsina básica é considerada cancerígena e mutagênica. Evite o contato com a pele, ingestão ou exposição a mucosas e membranas. Siga as instruções do fabricante e da SDS.
m Endo Agar LES contém peptonas como fontes de carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais. O extrato de levedura fornece vitaminas do complexo B, que estimulam o crescimento bacteriano. A lactose é o carboidrato. Os fosfatos são agentes tampão. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico do meio. Desoxicolato de sódio e lauril sulfato de sódio são adicionados como inibidores.
A
fucsina básica é um indicador de pH. O sulfito de sódio é adicionado para
descolorir a solução básica de fucsina. O ágar é o agente de solidificação.
Bactérias fermentadoras de lactose produzem acetaldeído que reage com o sulfito de sódio e fucsina para formar colônias vermelhas. O desenvolvimento de um brilho metálico ocorre quando o organismo produz aldeídos com a rápida fermentação da lactose. Se o inóculo for muito pesado, o brilho será suprimido. As bactérias não fermentadoras de lactose formam colônias claras e incolores.
Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion
Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.
As farmacopeias não apresentam as cepas para Grow Promotion, nesse caso pode-se utilizar os micro-organismos indicados no certificado do fabricante:
Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):
Escherichia coli ATCC 25922
Salmonella
enterica
subsp. Enterica sorotipo Typhimurium ATCC 14028
Verificar a inibição
Staphylococcus
aureus
ATCC 25923
Resultados esperados
Todas as colônias que são vermelhas e têm o brilho metálico característico são consideradas coliformes. O brilho pode cobrir toda a colônia, pode estar apenas no centro ou pode aparecer apenas nas bordas.
Outros
micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada. Nem
todos os listados acima precisam ser usados. Isso vai depender do método.
Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa do micro-organismo de interesse. No caso do S. aureus, conforme recomendação do fabricante, inocular 103.
Realizar GP em cada novo lote de meio de cultura adquirido pronto para uso ou preparado no laboratório, em paralelo com um meio de cultura previamente aprovado.
Os
micro-organismos devem ser rastreáveis de uma Cultura de Coleção de Referência
e devem estar em não mais do que 5 passagens da Cultura de Referência. Compare
o crescimento no novo meio de cultura com o crescimento no meio previamente
aprovado. O crescimento deve ser "comparável“. Não existe na USP a definição
de quantidade do que é “comparável” Em paralelo realizar o controle do inóculo
em ágar não seletivo: deve haver ≤ 100 UFC. E se não houver lote previamente
aprovado? Considere adicionar outros Analistas do Laboratório. Use um número significativo
de replicatas. A média das médias pode ser considerada como ponto de referência.
Essas recomendações servem para a promoção de crescimento de qualquer meio.
Limitações do procedimento
Ocasionalmente, organismos não coliformes podem produzir colônias brilhantes típicas. Organismos coliformes também podem ocasionalmente produzir colônias atípicas (colônias vermelhas escuras ou nucleadas sem brilho). É aconselhável verificar os dois tipos de colônia
Fontes:
United States Pharmacopeia 43ª ed. 2020
Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition
Farmacopeia
Brasileia 6ª ed. 2019
