Promoção
de crescimento é um teste fundamental para o controle de qualidade dos meios de
cultura utilizados na rotina laboratorial. Com ele podemos comprovar que o
meio utilizado atende os requisitos à que se propõe e assegura o resultado
final da análise.
No
post de hoje, vou colocar de maneira sucinta como proceder corretamente com o
teste de grow promotion, de modo a sanar possíveis dúvidas.
O que é Teste
de Promoção de Crescimento?
É
um teste que determina a adequação dos meios de cultura utilizados na rotina
laboratorial e é usado por farmacopeias em todo o mundo. Verifica a capacidade
que o meio tem em promover o crescimento microbiano.
A
promoção de crescimento consiste em inocular organismos testes adequados ao
tipo de meio.
Entende-se
por organismo teste: Um conjunto de organismos teste deve conter micro-organismos
com características estáveis, representativas de sua espécie e que sejam
confiáveis para demonstrar o desempenho de um meio preparado no laboratório. Os
organismos teste devem compreender as cepas que estejam facilmente disponíveis
nas coleções de cultura de referência, porém cepas bem caracterizadas, isoladas
no laboratório também podem ser incluídas.
Os
organismos teste para cada meio pode incluir:
- Cepas
positivas robustas com características típicas;
- Cepas
positivas que crescem fracamente (de uma natureza mais sensível);
- Cepas
não reativas bioquimicamente;
- Cepas
inibidas completamente.
Para
os meios que não contêm indicadores ou agentes seletivos, o uso de uma cepa
teste positiva simples, é adequado. Para os meios que contêm indicadores ou
agentes seletivos, devem ser utilizadas cepas que demonstrem a função do
indicador e seletividade. Para os meios complexos, como os adicionados de
suplemento, cada lote deve ser verificado com as cepas que apresentem as
características listadas acima.
Produtividade – Meios de
cultura líquidos, semissólidos e sólidos devem ser inoculados com inóculos apropriados
da cultura de trabalho dos organismos teste, utilizando um dispositivo
adequado. Para métodos quantitativos a produtividade é a relação entre a
contagem total de colônias no meio de cultura teste e contagem total de
colônias no meio de cultura de referência.
Seletividade – Para a avaliação
da seletividade em métodos quantitativos, utilizando dispositivos adequados e
organismos teste definidos, um meio de cultura seletivo e um meio de referência
são inoculados com inóculos apropriados dos organismos teste. Seletividade é a
diferença entre a maior diluição, apresentando crescimento acima de 10
colônias, no meio de referência e a maior diluição, apresentando crescimento
comparável, no meio teste.
Cuidado
especial deve ser dado à seleção das amostras e organismos a serem avaliados
nestes testes. Se organismos teste são utilizados na avaliação de meios não
seletivos, os organismos escolhidos devem ser tão fastidiosos quanto àqueles
para a qual o meio será utilizado rotineiramente. Recomenda-se que mais de um
organismo teste seja utilizado para avaliar um determinado meio.
Para
a avaliação de meios seletivos/diferenciais, devem ser escolhidos organismos
que testem as características seletivas/diferenciais e de produtividade do
meio. Meios líquidos podem ser avaliados utilizando organismos que devem
crescer no meio e àqueles que devem ser reprimidos. Seguindo com uma incubação
adequada, as concentrações devem ser determinadas para cada organismo teste. Um
meio aceitável deve apresentar altas concentrações do organismo esperado e
baixas concentrações do organismo reprimido. O desempenho de um novo lote deve
ser similar ao lote controle. A avaliação de um meio sólido é realizada de uma
maneira parecida.
Micro-organismos
do grupo para qual o meio é designado devem ser recuperados, quantitativamente,
quase comparado ao meio não seletivo. Organismos que devem ser reprimidos pelo
meio, não podem se desenvolver ou devem ser fortemente reduzidos, ao se
comparar com a enumeração do meio não seletivo.
Como escolher
os organismos testes?
Metodologias
(INCQS, AOAC) bem como as farmacopeias vigentes listam as cepas a serem
testadas em cada meio recomendado em seus métodos como, por exemplo, o capitulo
<61> da Farmacopeia Americana e o capitulo 5.5.3.1 da Farmacopeia
Brasileira. Há uma tabela com a cepa, seu ATCC, o meio ao qual se aplica e o
critério de aceitação.
Para
alguns casos, além das cepas farmacopeicas, o analista pode utilizar micro-organismos
“in house”, isolados ambientais do laboratório, fábrica ou outros. Para meios
de cultura não farmacopeicos, pode-se tranquilamente utilizar os organismos que
constam no certificado dos mesmos, bem como suas condições de incubação.
Quando e como
realizar o teste de promoção de crescimento?
A
promoção de crescimento deve ser realizada a cada lote produzido ou adquirido
pronto. Assim o analista garante a qualidade de todos os ensaios conduzidos com
estes meios.
- É
importante usar suspensões padronizadas das cepas testes e utilizar técnica de
manutenção de forma que o inóculo não ultrapasse 5 passagens do cultivo original.
Cultivar cada micro-organismo (bactéria e fungo) separadamente.
- Usar
solução tampão cloreto de sódio-peptona pH - 7,0 ou solução tampão fosfato pH
7,2 para preparar as suspensões dos micro-organismos. Ao preparar a suspensão
de esporos de A. brasiliensis,
adicionar à solução tampão 0,05% de polissorbato 80.
- Usar
as suspensões dentro de 2 horas ou dentro de 24 horas se mantidas à temperatura
de 2-8º C.
Para
realizar o teste, é necessário preparar inóculos das cepas a serem utilizadas,
numa concentração que não ultrapasse a contagem de 100 UFC/ml. É importante
utilizar um ágar não seletivo como um controle ao testar meios líquidos. Isso
garante que o meio líquido foi inoculado com < 100 UFC.
Com
os inóculos preparados e em temperatura ambiente, inocular nos meios a serem
testados. O uso de pipetas calibradas é fundamental.
Para
meios líquidos, basta pipetar o inóculo no tubo e agitar para uma
homogeneização. No caso dos meios em placa, o analista deve pipetar o inóculo
na placa e espalhar o mesmo com o auxilio de uma alça de Drigalsky. Incubar os
meios nas condições recomendadas para análise de rotina. Sempre levar em consideração a condições
ambientais exigidas pelas diferentes espécies. Use os indicadores para se
certificar que os ambientes anaeróbicos sejam mantidos.
Critérios de
aceitação
Para
caldos de enriquecimento, basta que haja turvação após a incubação comparando
com um branco (meio estéril). Já para ágar de contagem, é preciso avaliar a
recuperação. Quando eu atuava em laboratório, o parâmetro aceito era de no
mínimo 70% de recuperação. Hoje, os critérios mudaram. A farmacopeia brasileira
aceita uma recuperação mínima de 50%. Já a farmacopeia americana orienta: “para
meio sólido, o crescimento obtido não deve diferir por um fator maior que 2 a
partir do valor calculado para um inóculo padronizado. Isso se traduz em uma
recuperação de 50% -200%. Em outras palavras, se inocular 50 UFC de um inóculo
padronizado, uma recuperação entre 25-100 UFC é aceitável”. Cabe ao analista ou
as diretrizes do laboratório escolher o critério que lhe pareça melhor.
Já
para os meios seletivos, o crescimento dos micro-organismos devem apresentar as
características de coloração descritas nas especificações, por exemplo: no ágar
MacConkey, as colônias de coliformes fecais devem crescer com a coloração rosa
a avermelhada, enquanto que bactérias não fermentadoras não devem apresentar
coloração. Em contrapartida, não deve haver crescimento de colônias Gram
positivas, como Staphylococcus aureus,
pois o ágar MacConkey possui um inibidor de crescimento para tais bactérias.
Compare o crescimento no novo meio de cultura com o crescimento no meio
previamente aprovado.O crescimento deve ser "comparável“.Em paralelo realizar o controle do inóculo em ágar não seletivo: deve haver ≤ 100 UFC. Nenhum fator de 2 é necessário. Agar Cetrimide é um meio de cultura altamente seletivo. O principal agente
seletivo é a cetrimida.. Age como um detergente de amônio quaternário (QAC) e detergente catiônico. Inibe bactérias Gram-positivas e algumas Gram-negativas. É inibitório para Pseudomonas sp. mas não deve ser para P. aeruginosa. O Agar Cetrimide tende a ter um desempenho melhor se não for muito fresco (2 a 3
semanas após a fabricação). Executar teste paralelo no TSA demonstra conformidade (<100 UFC no TSA). A USP não limita o volume utilizado para o inóculo.
As recomendações são para executar uma validação completa do fornecedor de
meio de cultura..Os resultados entre 2 fabricantes podem ser significativamente diferentes: os
Auditores recomendam ter 2 fornecedores, para evitar qualquer atraso ou
problema de qualidade..Três lotes de meios de cultura para teste. E se não houver lote previamente aprovado? Considere vários técnicos. Use um
número significativo de replicatas. A média das médias pode ser considerada como
ponto de referência.
Esterilidade dos meios
Uma quantidade adequada de cada lote deve ser testada para verificar possível contaminação microbiana, através da incubação sob condições apropriadas, antes do uso ou em paralelo com a utilização do meio de cultura. Limites para a porcentagem de placas, tubos ou frascos com meio líquido, devem ser estabelecidos para cada meio, ou especificados pelo fabricante. “Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 35 ± 1°C por 24 horas para o controle de esterilidade.” Esterilidade Meios de cultura líquidos ou meios de cultura seletivos podem apresentar algumas dificuldades, devido à inibição de microrganismos. A contaminação pode não estar evidente visualmente, em forma de turbidez ou formação de colônia. Esta ocorrência pode ser superada através da transferência de uma porção do meio de cultura seletivo líquido para um meio de cultura não seletivo ou fazendo um swab da superfície da placa e incubando o swab em um meio não seletivo. “Não deve haver mudança de cor e nem crescimento de qualquer colônia.”
Mais
uma vez reforço a importância de documentar os dados obtidos. É um como um
mantra em controle de qualidade. É imprescindível um POP que descreva como a
promoção de crescimento deve ser realizada e documentada. Garante a rastreabilidade
e não gera dúvidas em auditorias.
Espero
que este post esclareça duvidas básicas. Deixem seus comentários! Afinal, o blog está aberto à discussões e melhorias.
Fontes:
brasil,
ANVISA. Farmacopeia Brasileira 5ª ed. 2010
UNITED
States Pharmacopeia. 37ª ed. 2014
PDS
HPPC. Guia de Microbiologia 1ª ed. 2015
Apresentação: Importância do Controle de Qualidade dos Meios de Cultura
aplicados à Indústria Farmacêutic Ministrado por Leticia Dias - Workshop Unifar sobre meios de cultura
