Cetrimide Agar

Indicação de uso

O meio Cetrimide Agar, também conhecido como Agar Cetrimida, BD Pseudosel Agar, Pseudomonas Selective Agar, é usado para o isolamento seletivo da Pseudomonas aeruginosa. É amplamente recomendado para uso em exame de cosméticos, espécimes clínicos, para o ensaio de pesquisa de P. aeruginosa, bem como para avaliar a eficácia de desinfetantes contra este organismo. Também é usado no controle de qualidade microbiológico de produtos farmacêuticos não estéreis para Pseudomonas aeruginosa atendendo a Farmacopeia Brasileira (FB), Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), Farmacopeia Europeia (EP) e Farmacopeia Japonesa (JP).

A Pseudomonas aeruginosa é um micro-organismo ambiental e um importante agente patogênico nosocomial (hospitalar).

King, E.O., M.K. Ward and D.E. Raney desenvolveram o Meio A (Tech Agar) para o aumento da produção de piocianina por Pseudomonas. Cetrimide ágar tem a fórmula desenvolvida para o Tech Agar, mas é modificado pela adição de cetrimida (brometo de cetiltrimetilamina) para a inibição seletiva de organismos que não P. aeruginosa.

Em 1951, Lowbury descreveu o uso de 0,1% de cetrimida em um meio para P. aeruginosa. Devido à maior pureza do agente inibidor, a concentração foi posteriormente reduzida, relatado por Lowbury e Collins em 1955. Brown e Lowbury empregaram a incubação a 37° C com exame após 18 e 42 horas de incubação.

Cepas de P. aeruginosa são diferenciadas de outras espécies pela produção de piocianina, um composto poliaromático com alta capacidade redox pertencente à classe das fenazinas, e é um metabólito secundário que participa de vários processos biológicos. Está envolvida em aquisição de ferro, metabolismo energético, comunicação célula-célula, virulência e confere vantagem competitiva à bactéria. P. aeruginosa é a única espécie de Pseudomonas ou bacilo gram negativo conhecido por excretar a piocianina. O ágar Cetrimide, portanto, é um meio de cultura valioso na identificação deste organismo.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• Hidrolisado de pancreático de gelatina - 20,0 g
• Cloreto de magnésio - 1,4 g
• Sulfato dipotássico - 10,0 g
• Cetrimida - 0,3 g
• Agar - 13,6 g
• Glicerol - 10,0 mL

O pH final é 7.2 ± 0.2

O hidrolisado de pancreático de gelatina serve como fonte de nitrogênio e o glicerol é usado como fonte de carbono e energia. A produção de piocianina é estimulada pelo cloreto de magnésio e o sulfato de potássio presentes no meio. A cetrimida (brometo de cetiltrimetilamina) é um composto amônio quaternário, que inibe uma vasta variedade de outros organismos, incluindo outras espécies de Pseudomonas e organismos relacionados. O Agar é o agente solidificante.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Esterilizar em autoclave

usando um ciclo validado.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Cetrimide Agar são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, ou NBRC 13275

Para verificar capacidade inibitória:

Escherichia coli ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, ou NBRC 3972

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa Pseudomonas.

Colônias que são cercadas por um pigmento azul-esverdeado e apresentam fluorescência sob um comprimento de onda curto (254 nm), a luz ultravioleta podem ser presumivelmente identificadas como Pseudomonas aeruginosa. No entanto, certas cepas de P. aeruginosa podem não produzir piocianina. Outras espécies de Pseudomonas não produzem piocianina, mas apresentam fluorescência sob luz UV. A maioria das espécies que não são Pseudomonas é inibida, e algumas espécies de Pseudomonas também podem ser inibidas. Coloração de Gram, testes bioquímicos e procedimentos sorológicos devem ser realizados para confirmar os achados.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Nascimento, A.P.B. (USP - Universidade de São Paulo); Baldini, R.L. (USP - Universidade de São Paulo) - Análise das regiões regulatórias dos operons phz de Pseudomonas aeruginosa

Xylose Lysine Deoxycholate Agar

Indicação de uso

O meio Xylose Lysine Deoxycholate Agar, também conhecido como Agar XLD, Ágar de desoxicolato-lisina-xilose ou Ágar Xilose, Lisina, Desoxicolato, é um meio para diferenciação moderadamente seletivo utilizado para o isolamento e diferenciação de elementos patogênicos entéricos gram-negativos (Salmonella e Shigella) provenientes de amostras clínicas. É especialmente adequado para o isolamento de espécies de Shigella. Atende a Farmacopeia Brasileira (FB), Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), Farmacopeia Europeia (EP) e Farmacopeia Japonesa (JP) para o ensaio de pesquisa de Salmonella em produtos não estéreis.

O Ágar de XLD foi desenvolvido por W. I. Taylor no sentido de aumentar a eficiência do isolamento e da identificação de elementos patogênicos entéricos, particularmente de Shigella. Os elementos patogênicos diferenciam-se não só dos organismos fermentadores de lactose não patogênicos, mas também de muitos elementos não patogênicos que não fermentam a lactose nem a sacarose. Além disso, o meio foi formulado para melhorar o crescimento de Shigella, que frequentemente, noutras formulações, não se desenvolveu devido à inclusão de inibidores tóxicos. Os resultados obtidos numa série de avaliação clínica corroboraram a reivindicação sobre a eficácia relativamente elevada do Ágar de XLD no isolamento primário de Shigella e Salmonella.

O Ágar XLD é um meio seletivo e diferencial usado para o isolamento e diferenciação de patógenos entéricos. O valor do Agar XLD no laboratório clínico é que o meio é mais favorável a organismos entéricos fastidiosos como o Shigella. O XLD Agar também é recomendado para testes de alimentos, produtos lácteos e água em métodos de teste padrão para várias indústrias. O Capítulo Geral <62> da USP que descreve métodos para pesquisa de patógenos em produtos farmacêuticos não estéreis cita o ágar XLD como meio sólido para isolamento de Salmonella, bem como a Farmacopeia Brasileira em seu capitulo 5.5.3.1 - Ensaios Microbiológicos Para Produtos Não Estéreis.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• Xilose - 3,5 g
• L-Lisina - 5,0 g
• Lactose monoidratada - 7,5 g
• Sacarose - 7,5 g
• Cloreto de sódio - 5,0 g
• Extrato de levedura - 3,0 g
• Vermelho fenol - 80,0 mg
• Agar - 13,5 g
• Desoxicolato de sódio - 2,5 g
• Citrato de amônio férrico - 0,8 g
• Tiossulfato de sódio - 6,8 g

O pH final é 7.4 ± 0.2

O extrato de levedura age como fonte de nutrientes e vitaminas do complexo B. O desoxicolato de sódio é usado como agente seletivo e, por isso, possui uma ação inibitória em relação aos micro-organismos gram positivos. A xilose é incorporada no meio uma vez que é fermentada por praticamente todos os elementos entéricos, exceto pelas Shigellae, e esta característica permite a diferenciação das espécies de Shigella. A lisina é incluída de modo a permitir que o grupo de Salmonella seja diferenciado dos elementos não patogênicos uma vez que, sem a lisina, as salmonelas rapidamente fermentariam a xilose, tornando-se impossível distingui-las das espécies não patogênicas. Depois das salmonelas terem acabado com a fonte de xilose, a lisina é atacada através da enzima lisina descarboxilase, revertendo a um pH alcalino que imita a reação da Shigella. De modo a evitar que se dê uma inversão deste tipo por coliformes positivos à lisina, adiciona-se lactose e sacarose para produzir ácido em excesso. Para aumentar a capacidade de diferenciação da formulação, inclui-se um sistema de indicador de H₂S, composto por tiossulfato de sódio e citrato de amônia férrico, para a visualização do sulfureto de hidrogênio, resultando na formação de colônias com centros pretos. Os produtores de H₂S não patogênicos não descarboxilam a lisina; assim, a reação ácida que produzem impede que as colônias se tornem negras, o que acontece apenas com um pH neutro ou alcalino.

Degradação de xilose, lactose e sacarose gera produtos ácidos, causando uma mudança de cor no meio de vermelho para amarelo.

Produção de sulfeto de hidrogênio sob condições alcalinas resultam em colônias com centros negros. Esta reação é inibida pelas condições ácidas que acompanham a fermentação de carboidratos.

Descarboxilação da lisina na ausência de fermentação de lactose e sacarose provoca reversão para uma condição alcalina e a cor do meio muda de volta para vermelho.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Aquecer até a ebulição. Não esterilizar em autoclave.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em XLD Agar são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Salmonella enterica ssp sorotipo typhimurium ATCC 14028 ou S. enterica ssp sorotipo abony NBRC 100797, NCTC 6017, ou CIP 80.39

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa Salmonella.

Quando há resultado positivo para Salmonella, as colônias crescem vermelho-amareladas com centros pretos.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010