Indicação
de uso
O meio Fluid Thioglycollate
Medium, também conhecido como Meio
Fluído de Tioglicolato é um meio de utilização geral para cultura de
anaeróbios, microaerófilos e aeróbios, e é recomendado como um dos meios de
teste da esterilidade em produtos farmacêuticos pelas farmacopeias americana e
brasileira, bem como a europeia e japonesa. É recomendado no Manual Analítico
Bacteriológico (BAM) do FDA e Official Methods of Analysis of AOAC
International para a análise de alimentos e para determinar o coeficiente de
fenol e efeitos esporicidas de desinfetantes.
Quastel e Stephenson
descobriram que a presença de uma pequena quantidade de um composto contendo um
grupo –SH (cisteína, ácido tioglicólico, glutationa) permitiu o crescimento
"aeróbico" de Clostridium
sporogenes em caldo de digestão tríptico.
Falk, Bucca e Simmons apontaram
as vantagens de usar pequenas quantidades de ágar (0,06-0,25%) na detecção contaminantes
durante testes de esterilidade de produtos biológicos. O valor de combinar uma
pequena quantidade de ágar e uma substância redutora foi demonstrado por
Brewer. Os experimentos de Brewer revelaram que em meio líquido contendo 0,05%
de ágar, os micro-organismos anaeróbios cresceram igualmente bem na presença ou
ausência de tioglicolato de sódio. Marshall, Gunnish e Luxen relataram
resultados satisfatórios sobre cultivo de anaeróbios no meio de tioglicolato de
Brewer na presença de um conservante mercurial. Nungester, Hood e Warren e Portwood
confirmaram a neutralização de o efeito bacteriostático de compostos mercuriais
pelo tioglicolato de sódio. A incorporação de peptona caseína foi introduzida por
Vera. Malin e Finn relataram que o meio comumente usado contendo tioglicolato é
inibitório para alguns organismos da presença de carboidratos. Em 1941, o National
Institutes of Health especificou o uso de dois meios de tioglicolato em testes
de esterilidade, a Fórmula Brewer e a Fórmula Linden. A Fórmula Linden foi
posteriormente denominada Modified Brewer Thioglycollate Medium no qual a
infusão de carne foi substituída por peptonas vegetais (soja).
Formulação
e Preparo
Fórmula
Aproximada Por Litro
- Digerido pancreático de caseína - 15,0 g
- L-cistina - 0,5 g
- Dextrose - 5,5 g
- Extrato de leveduras - 5,0 g
- Cloreto de sódio - 2,5 g
- Tioglicolato de sódio- 0,5 g
- Resazurina - 0,001 g
- Ágar - 0,75 g
O pH final é 7.1 ± 0.2
A dextrose, a peptona, a
L-cistina e o extrato de leveduras proporcionam os fatores de crescimento
necessários para a replicação bacteriana. O cloreto de sódio fornece mantem o equilíbrio
osmótico. O tioglicolato de sódio é um agente redutor que mantém uma baixa
tensão de oxigênio removendo o oxigênio molecular do ambiente, isto é, cria
condições anaeróbicas quando reduz o oxigênio molecular à água. Peróxidos, que
podem ser letais para muitos organismos anaeróbicos, não são formados sob essa
condição. A L-cistina também é um agente redutor, uma vez que contém grupos
sulfidrila que inativam os compostos de metais pesados e mantêm um potencial de
oxidação-redução baixo, suportando assim a anaerobiose. A resazurina é um
indicador de oxidação-redução que fica cor-de-rosa quando é oxidado e
transparente quando é reduzido. A adição de uma pequena quantidade de ágar no
meio tioglicolato ajuda no início e no crescimento de pequenos inóculos e
anaeróbios, impedindo a difusão de oxigênio no meio. Também retarda a dispersão
de CO2 e a substância redutora do microambiente ao redor do inóculo.
O preparo do meio deve seguir
as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar
de acordo com a qualificação do equipamento.
Nos casos em que os meios de
cultura são utilizados para o teste de esterilidade de penicilinas e cefalosporinas
pelo método de inoculação direta, a preparação do Meio fluido de tioglicolato deve
ser modificada conforme descrito a seguir: Transferir, assepticamente, para os
frascos esterilizados, contendo cada meio quantidade de β-lactamase suficiente
para inativar o antibiótico presente na amostra.
Micro-organismos
Indicados para o Teste de Grow Promotion
Os compêndios trazem uma lista
com os microrganismos a serem inoculados para o teste de grow promotion (também
conhecido como teste de promoção de crescimento ou capacidade nutritiva dos
meios de cultura). Outros micro-organismos, como cepas in house podem ser
inoculados também de modo a comprovar a capacidade do meio de recuperar os
mesmos. Inocular menos que 100 UFC do micro-organismo teste ao meio. Incubar à
temperatura adequada e observar o crescimento visível comparando com um
controle (branco) do mesmo meio de cultura.
Para verificar a esterilidade
dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na
temperatura adequada. Não deve haver crescimento de micro-organismos.
Os microrganismos citados pela
United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow
Promotion em Tioglicolato Fluido são:
Staphylococcus
aureus ATCC
6538, NCTC 10788, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276, INCQS 00039
Pseudomonas
aeruginosa ATCC
9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275, INCQS 00230
Clostridium
sporogenes ATCC
19404, NCTC 532, CIP 79.3, INCQS 00352 ou ATCC 11437, NCIMB 14239, CIP 100651,
NBRC 14293
Bacteroides
vulgatus
(ATCC 8482, NCTC 11154, INCQS 00059) pode ser utilizado alternativamente a Clostridium sporogenes, quando não for
necessário o uso de um micro-organismo esporulado.
Uma
alternativa a Staphylococcus aureus é
o Bacillus subtilis (INCQS 00001,
ATCC 6633, CIP 52.62, NBRC 3134, NCIMB 8054, NCTC 10400).
Um
micro-organismo alternativo para Pseudomonas
aeruginosa é a Kocuria rhizophila
(INCQS 00010, ATCC 9341, CIP 53.65, NCTC 8340).
O
teste de promoção de crescimento é considerado válido se houver evidência de
crescimento microbiano, visualizado pela turvação e/ou por métodos
microscópicos, após três dias de incubação dos meios inoculados com bactérias. Aeróbicos
estritos crescerão apenas na faixa rosa, Os microaerófilos crescerão perto do
fundo da banda, onde a concentração de oxigênio é menor. Os anaeróbios
facultativos e os anaeróbios aerotolerantes crescerão por todo o tubo. Os
anaeróbios facultativos crescem em todo o meio, mas mais concentrados na parte
inferior e os aeróbios facultativos crescem por toda a parte, mas mais no topo.
O facultativo cresce mais densamente onde o oxigênio está presente.
Fontes:
Difco
& BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition
United
States Pharmacopeia 40ª ed. 2017
Farmacopeia
Brasileia 6ª ed. 2019
