Fluid Thioglycollate Medium

Indicação de uso

O meio Fluid Thioglycollate Medium, também conhecido como Meio Fluído de Tioglicolato é um meio de utilização geral para cultura de anaeróbios, microaerófilos e aeróbios, e é recomendado como um dos meios de teste da esterilidade em produtos farmacêuticos pelas farmacopeias americana e brasileira, bem como a europeia e japonesa. É recomendado no Manual Analítico Bacteriológico (BAM) do FDA e Official Methods of Analysis of AOAC International para a análise de alimentos e para determinar o coeficiente de fenol e efeitos esporicidas de desinfetantes.

Quastel e Stephenson descobriram que a presença de uma pequena quantidade de um composto contendo um grupo –SH (cisteína, ácido tioglicólico, glutationa) permitiu o crescimento "aeróbico" de Clostridium sporogenes em caldo de digestão tríptico.

Falk, Bucca e Simmons apontaram as vantagens de usar pequenas quantidades de ágar (0,06-0,25%) na detecção contaminantes durante testes de esterilidade de produtos biológicos. O valor de combinar uma pequena quantidade de ágar e uma substância redutora foi demonstrado por Brewer. Os experimentos de Brewer revelaram que em meio líquido contendo 0,05% de ágar, os micro-organismos anaeróbios cresceram igualmente bem na presença ou ausência de tioglicolato de sódio. Marshall, Gunnish e Luxen relataram resultados satisfatórios sobre cultivo de anaeróbios no meio de tioglicolato de Brewer na presença de um conservante mercurial. Nungester, Hood e Warren e Portwood confirmaram a neutralização de o efeito bacteriostático de compostos mercuriais pelo tioglicolato de sódio. A incorporação de peptona caseína foi introduzida por Vera. Malin e Finn relataram que o meio comumente usado contendo tioglicolato é inibitório para alguns organismos da presença de carboidratos. Em 1941, o National Institutes of Health especificou o uso de dois meios de tioglicolato em testes de esterilidade, a Fórmula Brewer e a Fórmula Linden. A Fórmula Linden foi posteriormente denominada Modified Brewer Thioglycollate Medium no qual a infusão de carne foi substituída por peptonas vegetais (soja).

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Digerido pancreático de caseína - 15,0 g
• L-cistina - 0,5 g
• Dextrose - 5,5 g
• Extrato de leveduras - 5,0 g
• Cloreto de sódio - 2,5 g
• Tioglicolato de sódio- 0,5 g
• Resazurina - 0,001 g
• Ágar - 0,75 g 

O pH final é 7.1 ± 0.2

A dextrose, a peptona, a L-cistina e o extrato de leveduras proporcionam os fatores de crescimento necessários para a replicação bacteriana. O cloreto de sódio fornece mantem o equilíbrio osmótico. O tioglicolato de sódio é um agente redutor que mantém uma baixa tensão de oxigênio removendo o oxigênio molecular do ambiente, isto é, cria condições anaeróbicas quando reduz o oxigênio molecular à água. Peróxidos, que podem ser letais para muitos organismos anaeróbicos, não são formados sob essa condição. A L-cistina também é um agente redutor, uma vez que contém grupos sulfidrila que inativam os compostos de metais pesados e mantêm um potencial de oxidação-redução baixo, suportando assim a anaerobiose. A resazurina é um indicador de oxidação-redução que fica cor-de-rosa quando é oxidado e transparente quando é reduzido. A adição de uma pequena quantidade de ágar no meio tioglicolato ajuda no início e no crescimento de pequenos inóculos e anaeróbios, impedindo a difusão de oxigênio no meio. Também retarda a dispersão de CO₂ e a substância redutora do microambiente ao redor do inóculo.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

Nos casos em que os meios de cultura são utilizados para o teste de esterilidade de penicilinas e cefalosporinas pelo método de inoculação direta, a preparação do Meio fluido de tioglicolato deve ser modificada conforme descrito a seguir: Transferir, assepticamente, para os frascos esterilizados, contendo cada meio quantidade de β-lactamase suficiente para inativar o antibiótico presente na amostra.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Os compêndios trazem uma lista com os microrganismos a serem inoculados para o teste de grow promotion (também conhecido como teste de promoção de crescimento ou capacidade nutritiva dos meios de cultura). Outros micro-organismos, como cepas in house podem ser inoculados também de modo a comprovar a capacidade do meio de recuperar os mesmos. Inocular menos que 100 UFC do micro-organismo teste ao meio. Incubar à temperatura adequada e observar o crescimento visível comparando com um controle (branco) do mesmo meio de cultura.

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de micro-organismos.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Tioglicolato Fluido são:

Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCTC 10788, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276, INCQS 00039

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275, INCQS 00230

Clostridium sporogenes ATCC 19404, NCTC 532, CIP 79.3, INCQS 00352 ou ATCC 11437, NCIMB 14239, CIP 100651, NBRC 14293

Bacteroides vulgatus (ATCC 8482, NCTC 11154, INCQS 00059) pode ser utilizado alternativamente a Clostridium sporogenes, quando não for necessário o uso de um micro-organismo esporulado.

Uma alternativa a Staphylococcus aureus é o Bacillus subtilis (INCQS 00001, ATCC 6633, CIP 52.62, NBRC 3134, NCIMB 8054, NCTC 10400).

Um micro-organismo alternativo para Pseudomonas aeruginosa é a Kocuria rhizophila (INCQS 00010, ATCC 9341, CIP 53.65, NCTC 8340).

O teste de promoção de crescimento é considerado válido se houver evidência de crescimento microbiano, visualizado pela turvação e/ou por métodos microscópicos, após três dias de incubação dos meios inoculados com bactérias. Aeróbicos estritos crescerão apenas na faixa rosa, Os microaerófilos crescerão perto do fundo da banda, onde a concentração de oxigênio é menor. Os anaeróbios facultativos e os anaeróbios aerotolerantes crescerão por todo o tubo. Os anaeróbios facultativos crescem em todo o meio, mas mais concentrados na parte inferior e os aeróbios facultativos crescem por toda a parte, mas mais no topo. O facultativo cresce mais densamente onde o oxigênio está presente.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019