Meios Cromogênicos para Detecção de Coliformes Totais e Termotolerantes em Água

Indicação de uso

São meios de cultura contendo na sua formulação substratos enzimáticos específicos que possibilitam melhorias significativas na recuperação dos micro-organismos e na identificação dos mesmos, para análise em amostras de água potável, água bruta, água superficial, água subterrânea, água de reuso, água para uso farmacêutico, água purificada em geral, água engarrafada e efluentes, sem necessidade de reagentes adicionais para confirmação. A Farmacopeia Brasileira cita o uso e a Farmacopeia Americana cita como método o Standard Methods For The Examination Of Water And Wastewater, que por sua vez também cita o uso, mais precisamente do Colilert®, em que vou me basear para este artigo. Existem outras marcas, mas aqueles que forem auditados pelo INMETRO, recomenda-se o uso do Colilert®. Este pode ser usado para teste de ausência ou presença ou para teste quantitativo.

Princípio do Método

O teste Colilert® usa a exclusiva Tecnologia do Substrato Definido - Defined Substrate Technology (DST) para detectar simultaneamente coliformes totais e E. coli. Dois indicadores nutrientes, ONPG e MUG, são as principais fontes de carbono no Colilert e podem ser metabolizados pela enzima dos coliformes β-galactosidase, e pela enzima da E. coli β-glucuronidase, respectivamente.

À medida que os coliformes crescem no teste Colilert, eles usam β-galactosidase para metabolizar ONPG e mudam sua cor de incolor para amarelo. 

E. coli usa β-glucuronidase para metabolizar MUG e criar fluorescência. Tendo em conta que a maioria dos não coliformes não tem estas enzimas, eles são incapazes de crescer e interferir. Os poucos não coliformes que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz especificamente formulada do teste Colilert®. A presença da E. coli pode ser confirmada por fluorescência sob a luz UV, devido sua atuação sobre o substrato MUG.

Esta abordagem é diferente dos meios tradicionais, que proporcionam um ambiente rico em nutrientes que favorecem o crescimento de organismos classificados como alvo e não alvo. Quando os organismos não alvo crescem e imitam os organismos classificados como alvo, ocorrem falso positivos. O crescimento de organismos não alvo também pode suprimir os organismos alvo e originar falso negativos nos meios tradicionais. Para suprimir organismos não alvo, os meios tradicionais incluem frequentemente elevados níveis de sais, detergentes ou outros agentes seletivos que podem inadvertidamente suprimir os organismos alvo e originar falso negativos.

O sistema de reagente foi concebido para suprimir bactérias não coliformes positivas para ONPG ou MUG por pelo menos 28 horas. Se a incubação ultrapassar as 28 horas, é possível que essas bactérias ultrapassem o sistema de supressão do teste Colilert® e reajam com ONPG ou MUG. Quando a incubação excede as 28 horas, apenas são válidos os resultados negativos. Os resultados positivos devem ser confirmados usando métodos tradicionais.

Leitura de Resultados

·         Incolor = negativo

·         Amarelo = coliformes totais

·         Amarelo/fluorescente = E. coli

No link abaixo pode-se acessar um vídeo explicando o uso:

https://www.google.com.br/search?q=Colilert+Manual+pdf&sca_esv=87faeafcc4202842&sxsrf=ADLYWILzgzdotimY5wNQTyrL_Xc4K7e1qA:1723505101697&ei=zZm6ZqCcKq7Y1sQP1ZTlgQE&start=10&sa=N&sstk=AagrsuizwaI2c2mE_nPr3vzHWWvEmoCKfa3M6D12i6EpmPs0bYpirSIICpIanxG5-DCuZvtw0fShWlhXz2vIS5HeVJM8lbPgWM1hkA&ved=2ahUKEwjgtuvqzPCHAxUurJUCHVVKORAQ8tMDegQIPhAE&biw=1360&bih=599&dpr=1#fpstate=ive&vld=cid:2b127b64,vid:Qwf3zf8RPLI,st:0

Fontes:

United States Pharmacopeia 43ª ed. 2020

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2024

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 23ª ed.

https://www.idexx.com.br/pt-br/water/water-products-services/colilert/ acessado em 12/08/2024

PCA Agar (Plate Count Agar)

 

Indicação de uso 

O Ágar PCA (Plate Count Agar) ou Ágar Contagem de Placas é usado ​​para obter contagens de placas microbianas de leite e produtos lácteos, alimentos, água e outros materiais de importância sanitária. O ágar PCA é recomendado em métodos padrão para contagem pela técnica de pour plate, spread plate e filtração de membrana para contagem de bactérias heterotróficas em placas. É o meio indicado no Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, citado na farmacopeia americana e farmacopeia brasileira como opção de ágar para contagem em água. Ele é recomendado para obter contagens de placas em amostras de leite e outros produtos lácteos e também pode ser usado para determinar a qualidade sanitária de alimentos, água e outros materiais.

 Formulação e Preparo

 Fórmula Aproximada Por Litro

• Peptona de caseína - 5,0 g
• Extrato de levedura - 2,5 g
• Glicose ou dextrose - 1,0 g
• Ágar - 15,0 g

A peptona de caseína fornece os aminoácidos e outras substâncias nitrogenadas complexas necessárias para sustentar o crescimento de bactérias. O extrato de levedura fornece principalmente vitaminas do complexo B e a glicose ou dextrose é uma fonte de energia. Agar é o agente solidificante.

pH 7,0 ± 0,1. Esterilizar em autoclave usando ciclo validado.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante.

O Ágar PCA tem alta concentração de nutrientes, sendo adequados para isolamento geral e enumeração de bactérias heterotróficas ou copiotróficas (bactérias que consomem grande quantidades de carbono). A temperatura e tempo de incubação são aspectos críticos para os testes microbiológicos da água, devido aos tipos de micro-organismos encontrados nos sistemas de água. Incubações a baixas temperaturas (por exemplo, de 20 °C a 25 °C ou de 25 °C a 30 °C) por períodos mais longos, por pelo menos quatro dias, podem levar a recuperações mais altas de micro-organismos, do que as temperaturas clássicas. Os meios com baixa quantidade de nutrientes requerem períodos de incubação mais longos (pelo menos cinco dias), pois esses meios promovem crescimento mais lento. Mesmo aqueles com alta concentração de nutrientes podem algumas vezes resultar em alta recuperação microbiana por longos períodos de incubação e temperaturas mais baixas. A decisão sobre o tipo de meio de cultura e a temperatura de incubação para se testar um sistema de purificação de água deve ser baseada em estudos comparativos de cultivo usando um microbioma nativo dos sistemas de purificação da água em análise.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

As farmacopeias não apresentam as cepas para Grow Promotion, nesse caso pode-se utilizar os micro-organismos indicados no certificado do fabricante:

Para promoção de crescimento

Staphylococcus aureus ATCC 25923                

Bacillus subtilis ATCC 6633                

Escherichia coli ATCC 25922

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa do micro-organismo de interesse.

Realizar GP em cada novo lote de meio de cultura adquirido pronto para uso ou preparado no laboratório, em paralelo com um meio de cultura previamente aprovado.

Os micro-organismos devem ser rastreáveis de uma Cultura de Coleção de Referência e devem estar em não mais do que 5 passagens da Cultura de Referência. Compare o crescimento no novo meio de cultura com o crescimento no meio previamente aprovado. O crescimento deve ser “comparável”. Não existe na USP a definição de quantidade do que é “comparável” Em paralelo realizar o controle do inóculo em ágar não seletivo: deve haver ≤ 100 UFC. E se não houver lote previamente aprovado? Considere adicionar outros Analistas do Laboratório. Use um número significativo de replicatas. A média das médias pode ser considerada como ponto de referência. Essas recomendações servem para a promoção de crescimento de qualquer meio.

Fontes:

United States Pharmacopeia 43ª ed. 2020

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2024

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 23ª ed.