Manutenção de Cepas Microbianas

Tenho acompanhado em grupos de microbiologia dúvidas em relação à manutenção de cepas microbianas. Isso é um ponto muito importante na rotina de um laboratório, uma vez que as cepas são utilizadas para o grow promotion, bem como para testes de desafio de conservantes, validações de sanitizantes e de métodos.

Com base nisto, estou criando este post para esclarecer parte destas dúvidas e quem sabe começar uma discussão para troca de experiências.

As três perguntas mais frequentes

• Quantas vezes posso repicar meus microrganismos?
• Posso congelar meus microrganismos?
• Como eu posso manter meus microrganismos?

Quantas vezes posso repicar meus microrganismos?

Existem limitações:

• O tipo de teste pode limitar o número de passagens;
• O risco de mutações, limita o número de repiques.

Os repiques ou passagens significam que os microrganismos estão sendo transferidos de um meio para outro.

O tipo de teste pode limitar o número de passagens

• Microrganismos usados em teste baseado na farmacopeia, como promoção de crescimento e teste de eficácia de conservantes não devem ter mais do que 5 passagens a partir da cultura de referência.

Aqui vale lembrar a importância de verificar com seu fornecedor em que geração está sua cepa de referência, para que você saiba até quando você pode usá-la.

O risco de mutações, limita o número de repiques

• É recomendável a conservação de repiques mínimos. A 9ª edição do Manual de Microbiologia Clínica alerta, "Cada transferência de um novo repique aumenta a probabilidade de mutações com indesejáveis chances de mudanças na característica do microrganismo.

Mutações ocorrem:

• Aleatoriamente;
• Frequentemente devido ao alto nível de replicações (por exemplo, sob condições ideais uma cepa de Staphylococcus pode se dividir a cada 30 minutos).

Importante:

Laboratórios precisam revisar seus processos de gerenciamento e preservação no controle de processos de cepas e no trabalho com culturas porque:

• Variações genéticas podem afetar fenotipicamente e fisiologicamente traços da cepa ao longo do tempo;
• Variações genéticas podem ter um impacto significante nos métodos moleculares e no resultado de análises.

Possíveis ramificações das cepas mutantes

• Falha nos testes de meios seletivos;
• Resultados incorretos de susceptibilidade;
• Identificação incorreta de isolados;
• Falhas nas auditorias e perda de certificações;
• Perda de clientes.

Posso congelar os meus microrganismos?

Não é um processo recomendado porque:

• Existe alto risco de mutação neste processo;
• Congelamento tem alto custo.

Risco de mutações

• Congelamento de microrganismos a -20ºC podem danificar a célula do mesmo devido a formação de cristais de gelo e flutuações eletrolíticas;
• Podem também ocorrer danos na célula durante o descongelamento;
• Considera-se temperaturas críticas entre -40ºC e -5ºC;
• Aquecimento indesejado, pode ocorrer com perda de energia e consequentemente danificar as células dos microrganismos

Congelamento tem alto custo

Os custos incluem:

• Baixas temperaturas;
• Gerador para sistemas de back-up;
• Frascos especiais para congelamento e armazenamento;
• Sistema de alarme em caso de queda de energia;
• Obrigatório (tempo gasto para a validação de métodos de congelamento, descongelamento, congelamento, etiquetagem, manutenção de registros etc;
• Retestes e análises de causa raiz, caso ocorra mutações.

Obs.: O congelamento não é um método proibido, mas que gera custos, uma vez que o ideal é o uso de um ultrafreezer (que congela a -80ºC). É um equipamento por si só caro, e como exposto acima, requer um controle rígido de queda de temperatura em caso de falta de energia. É preciso avaliar com cuidado se o seu laboratório tem condições de manter as cepas congeladas adequadamente.

Regras simples para estocar microrganismos

• Indica-se a armazenagem de bactérias aeróbias em temperaturas entre 2-8ºC (poucas espécies de Bacillus irão permanecer viáveis por longos períodos, quando estocados em temperatura ambiente);
• Indica-se o armazenamento de cepas que requerem CO2, à temperatura ambiente em jarras de anaerobiose com gerador;
• Leveduras e bolores devem ser armazenadas em temperatura ambiente (lembrando que a temperatura do laboratório deve ser controlada de acordo com a BPF);
• Pode se armazenar cepas anaerobias e aeróbias à temperatura entre 2-8ºC;
• Não testar colônias da placa ou slant originais. Este é o local sobre o qual o sedimento liofilizado foi iniciado. Os organismos que crescem neste local não estão totalmente viáveis;
• Sempre utilizar microrganismos frescos para realização dos testes;
• Muitos testes exigem que os microrganismos não tenham mais do que 24 horas;
• Sempre selecione colônias isoladas para o seu teste;
• Estocar o microrganismo em meios de cultura adequados ao mesmo (bactérias em TSA ou agar nutriente e fungos em SDA). No caso de cepas de Clostridium pode-se usar o caldo Reinforced Clostridial Medium. 

Uma última consideração é a importância de adquirir cepas de fornecedores qualificados e manter registros atualizados de seu cepario. Como tudo na rotina laboratorial, tudo deve ser documentado e possuir certificados, para não gerar dúvidas em auditorias e manter a rastreabilidade de dados em caso de uma investigação em um desvio analítico. As cepas adquiridas devem vir com certificados e instruções que garantam o uso correto das mesmas.

Espero que este artigo seja útil para esclarecer dúvidas básicas. Caso surjam outras, toda discussão é válida!

Fonte: Catálogo Plastlabor