Meios de Cultura

É de grande importância que o microbiologista saiba como preparar, testar a qualidade e utilizar de maneira correta os meios de cultura, afinal 99% das análises microbiológicas clássicas dependem do uso dos mesmos (acredito que só o ensaio de endotoxinas não requer o uso de meios). A escolha da marca e do tipo de meio vai fazer uma grande diferença no resultado final da análise. Quando eu era supervisora, todo estagiário ou analista novo começava no preparo dos meios, pois sabendo como preparar e realizar os controles de qualidade, o profissional terá uma compreensão melhor sobre o assunto.

No post de hoje, vou falar brevemente sobre os tipos de meios e os controles que devem ser aplicados aos mesmos, para garantir sua qualidade.

Tipos de Meios de Cultura     

Quanto à consistência:

• Líquido: é aquele em que nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa. Exemplo: Caldo Nutriente, TSB (Tryptic Soy Broth).
• Semissólido: este meio possui na sua composição, além dos nutrientes, ágar em uma pequena porcentagem (0,075 a 0,5 %), dando uma consistência intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas. Exemplo: Meio SIM (Sulfato Indol Motilidade).
• Sólido: é um meio que possui na sua composição nutrientes em torno de 15g de ágar/1.000 ml de água destilada. Exemplo: Agar Saboraud, TSA (Tryptic Soy Agar), Agar Nutriente.

Quanto à função:

• Meios de pré-enriquecimento: são aqueles que permitem a dessensibilização de microrganismos injuriados, para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). Ex. Água peptonada, caldo lactosado (isolamento de salmonelas de leite em pó).
• Meios de Enriquecimento: quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros. Ex. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas (líquidos), Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens.
• Diferenciais: quando contém substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), Ágar MacConkey para a diferenciação de enterobactérias, Ágar sangue, ágar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos).
• Seletivos: os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. Exemplo: meios com telurito de potássio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae), ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey, meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella, meios com 7,5% de cloreto de sódio, meio Baird-Parker, para isolamento de Staphylococcus aureus, meios com antibióticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC, SFP, meio de Blaser, meio de Skirrow etc.). A maioria deles é também diferencial, permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microrganismos.
• Meios de triagem: meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro, meio Instituto Adolfo Lutz, uréia, etc.).
• Identificação: presta-se para a realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos à identificação (meios Oxidação/Fermentação, Ágar Citrato, Caldo nitrato, meio semissólido, caldo triptofano, meio de Sulfito Indol Motilidade etc.
• Dosagem: empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e aminoácidos;
• Contagem: empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (Agar de Contagem em Placas, TSC, Agar Batata Dextrose, Ágar Baird-Parker, etc.).
• Estocagem ou manutenção: utilizados para conservação de microrganismos no laboratório, garantem a viabilidade de microrganismos (Ágar Sabouraud, Meios com leite, Ágar suco de tomate, Ágar sangue, Ágar Simples, meio semissólido, etc.).

Quanto à Natureza:

• Animados: cultura celular
• Inanimados: natural (leite), sintéticos (Manitol Salt Agar) e semissintéticos (Ágar Sangue).

Preparação e Distribuição de Meios de Cultura

• Usar EPIs para o preparo de meios de cultura (máscaras, jaleco de manga longa e touca).
• Observar os riscos indicados nos rótulos dos frascos de meios de culturas e de reagentes químicos e fazer uso de EPIs específicos (máscaras, óculos de proteção e luvas).
• Usar vidrarias limpas, secas e sem trincos ou defeitos. Utilizar vidraria (balão de fundo chato, placa de Petri, tubo de ensaio, frasco, pipeta e outras Vidrarias auxiliares) em vidro neutro temperado, termo resistente com parede uniforme e reforçado.
• Esterilizar a vidraria pelo processo de calor seco (forno Pasteur) 170ºC por 120 minutos ou 180°C por 60 minutos ou por calor úmido seguindo o tempo qualificado da autoclave.
• Usar água destilada, deionizada, ou produzida por osmose reversa na preparação de meios de cultura e soluções.
• Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água.
• Os meios comerciais e preparados não comerciais devem ser pesados separadamente em papel manteiga e adicionados em uma vidraria adequada, hidratar em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido. Agitar firmemente por alguns segundos até obter uma suspensão homogênea. Escorrer o restante da água pela parede para retirar qualquer material aderente.
• Ajustar o pH dos meios preparados não comerciais com solução de HCl e NaOH 0,1N ou 1N. Nos meios contendo Ágar, pesar o Ágar separadamente e acrescentar após o ajuste do pH para não obstruir o eletrodo. O pH dos meios comerciais, normalmente, não precisa ser reajustado, mas deve ser verificado a cada lote. Alguns laboratórios verificam o pH apenas antes da esterilização. Outros, mais criteriosos, também verificam após. Para os meios líquidos, separe uma quantidade do lote preparado. No caso de meios sólidos, uma vez que não é possível usar o eletrodo, são isentos da verificação. Existe um eletrodo especifico para placas de Petri, mas eu pessoalmente nunca usei.
• Dissolver os meios líquidos e soluções com agitação e leve aquecimento (não abrir fervura).
• Aquecer os meios contendo Ágar até ferver com constante agitação. A parede da vidraria deve estar lisa sem pontos de Ágar. Caso observe pontos, a fervura não foi suficiente para a total dissolução. Retornar ao fogo para finalizar o procedimento. Caso não seja possível o aquecimento, recomento homogeneizar bem o meio antes de coloca-lo em cada frasco ou tubo, pois há o risco de que um recipiente contenha ágar em excesso e outro fique praticamente sem. Isto aplica-se quando se prepara 2 litros de meio em um béquer e o mesmo será subdividido em frascos de 250 ml, por exemplo.
• Sempre que for necessário o aquecimento dos meios, usar vidro termo resistente tipo Pyrex® e aquecer sobre a tela de amianto ou similar e tripé, no bico de Bunsen ou em placa aquecedora.
• Usar sempre luvas térmicas apropriadas para laboratório para manipular vidrarias quentes.
• Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilização deve ser o tempo validado da autoclave quando o equipamento for qualificado. Embora a recomendação geral dos fabricantes seja de 15 minutos à 121ºC, esse tempo varia de equipamento para equipamento, e com o passar do tempo, o mesmo equipamento pode apresentar uma variação, sendo necessário verificar esse tempo quando for realizada a qualificação. Alguns meios também possuem temperaturas especificas, como por exemplo, o caldo Rappaport Vassiliadis, utilizado para pesquise de Salmonella, que requer autoclavação à 115ºC, deste modo é necessário validar um ciclo da autoclave somente para ele.
• Sempre que for usado o termo “esterilizar por filtração”, usar membrana composta por ésteres de celulose ou polímeros plásticos e com porosidade de 0,22μm de diâmetro, recomendado para reter partículas bacterianas. A esterilização por filtração é utilizada quando o material é sensível ao calor, como alguns meios de cultura, soluções de açúcares, soluções de antibióticos e outros.
• Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados.
• Quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estéreis.
• Os meios devem ser autoclavados com as tampas semiabertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor. Vale reforçar a montagem adequada da carga, de modo que permita a circulação de vapor entres os frascos e tubos. Cargas muito cheias podem não ser esterilizadas de modo adequado.
• Meios sólidos que precisam ser plaqueados, geralmente são dissolvidos em micro-ondas ou até mesmo em autoclave, depende da rotina do laboratório, e uma vez dissolvidos, o ideal é mantê-los em banho maria até o uso. Em algumas discussões recentes, li que o INMETRO tem exigido um controle rígido da temperatura dos meios dissolvidos, baseado em informações encontradas no Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Eles recomendam medir a temperatura antes do plaqueamento, pois se o meio estiver muito quente, pode matar os microrganismos presentes na amostra ou inóculo. A temperatura recomendada é de 45 a 50ºC.

Controle de Qualidade de Esterilidade e Crescimento

• Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 30 a 35°C por 24 horas para o controle de esterilidade.
• Não deve haver mudança de cor nem crescimento de qualquer colônia.
• Para o controle de crescimento (grow promotion), sempre que possível usar cepas ATCC, que são cepas de referências de origem e padrão definido de provas para a sua caracterização.
• Se não for possível o uso de cepas ATCC, usar cepas 100% positivas para os controles de qualidade de crescimento realizados.
• Controlar a eficácia da autoclave ou estufa, realizando semanalmente testes biológicos para essa finalidade. Os testes biológicos para autoclaves a vapor são os que contêm 10⁶ Geobacillus stearothermophilus e os testes biológicos para estufa de calor seco contêm 10⁶ Bacillus subtilis.

Obs.: O Grow promotion é um teste de grande importância, tanto que merece um post dedicado a ele.

Recomendações Gerais

• Evitar usar meios vencidos (liofilizados e prontos para uso).
• Não usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados.
• Observar com atenção para as instruções de alguns inóculos que são específicos para alguns meios de cultura.
• Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rápido do meio.
• Evitar o uso de sacos plásticos para embalar as placas, pois a água de condensação formada facilita a proliferação de fungos.
• Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de fabricação, data de validade e tipo de armazenamento. Manter registros bem detalhados facilita a rastreabilidade dos dados e futuros questionamentos em auditorias. No caso de frascos, não colocar a identificação somente na tampa, eu recomendo colocar no frasco, pois o analista pode trocar acidentalmente a tampa e causar confusão. Eu identificava meios liberados para uso com uma etiqueta verde e os que estavam em quarentena com uma etiqueta vermelha, tanto na tampa, quanto no frasco. No caso de tubos, identificar a estante e cada tubo de ensaio seria o ideal, mas para grandes quantidades de tubos, identificar a estante de modo a não gerar dúvidas de qual o meio contido nos tubos.

Fabricar os meios ou compra-los prontos?

Essa questão vai da capacidade do laboratório e a demanda de análises rotineiras. A fabricação permite um bom controle dos seus meios de cultura, mas é uma tarefa que impacta na rotina, uma vez que se não houver um funcionário dedicado à preparação, um analista terá que parar suas análises para prepara-los e realizar todo o controle. Existem boas opções prontas no mercado, que podem suprir as necessidades diárias. Cabe uma análise cuidadosa de custo beneficio.

Qual o meio mais adequado para minha análise?

Existe uma gama infinita de meios de cultura disponível hoje no mercado. A escolha do meio apropriado vai do analista ou das diretrizes da empresa. Geralmente os laboratórios seguem métodos compendiais ou instruções normativas, que dispensa a validação dos mesmos, segundo a Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003. Mas nada impede que o analista escolha um meio diferente do método compendial e que lhe pareça mais adequado. Basta validar este meio frente ao meio indicado na metodologia de modo a comprovar que os resultados obtidos serão os mesmo para ambos.

Enfim, este assunto é extenso, e como já havia escrito aqui eu fiz um resumo. Qualquer dúvida sintam-se a vontade e deixem suas sugestões nos comentários.

Fontes:

Ribeiro, M.C.; soares, M.M.S.R. - Microbiologia Prática – Roteiro e Manual

brasil, ANVISA - Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à

Assistência à Saúde

BRASIL. Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003 Determina a publicação do "Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos", publicado no Diário Oficial da União; Poder Executivo, de 02 de junho de 2003.