EMB Agar

 

Indicação de uso

O EMB Agar, também conhecido como Eosina Azul de Metileno, Eosin Methylene Blue Agar, Levine EMB Agar ou Levine Eosin–Methylene Blue–Agar Medium (LEMB-Agar) é um meio seletivo utilizado para pesquisa de E. coli em amostras de Suplementos Nutricionais E Dietéticos descrito no capitulo 〈2022〉 MICROBIOLOGICAL PROCEDURES FOR ABSENCE OF SPECIFIED MICROORGANISMS—NUTRITIONAL AND DIETARY SUPPLEMENTS, USP e também citado como opção de meio em pesquisa de coliformes fecais em água na Farmacopeia Brasileira e no Standard Methods for Examination of Water & Wastewater. O EMB é um meio para diferenciação ligeiramente seletivo também utilizado para o isolamento e diferenciação de bacilos entéricos gram-negativos (enterobactérias e outros bastonetes gram-negativos) provenientes de amostras clínicas. É recomendado pelo APHA para análise de alimentos e lácteos. O EMB ágar (com ou sem sacarose) é incluído no conjunto de meios de isolamento de seletividade reduzida para a Salmonella de amostras fecais e de outro tipo. As bactérias gram-positivas como, por exemplo, estafilococos, leveduras e estreptococos fecais, poderão desenvolver-se neste meio e formar colônias punctiformes ou poderão ficar inibidas.

Logo após a publicação de Holt-Harris e Teague de um artigo que descreve um novo meio de cultura para a diferenciação de micro-organismos entéricos através do uso de eosina e corantes de azul de metileno, Levine descreveu uma modificação de sua formulação, que ele afirma ter dado melhor diferenciação entre o que agora é conhecido como Escherichia e Enterobacter espécie. As duas formulações diferem em que Levine EMB Agar não contém sacarose. Ambas as formulações foram desenvolvidas para melhorar as propriedades diferenciadoras de Endo Agar, que foi desenvolvido anteriormente.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro (Ajustada e/ou suplementada conforme necessário para cumprir os critérios do desempenho)

• Hidrolisado pancreático de gelatina - 10,0 g
• Lactose - 10 g
• Fosfato dipotássio - 2,0 g
• Agar- 15 g
• Eosina Y - 400 mg
• Azul-de-metileno - 65 mg

O pH 7,1 ± 0,2

O hidrolisado e a lactose servem como fonte de energia. Fosfato dipotássio é um agente tamponante. Agar é um agente solidificante.  Os corantes de eosina Y e azul de metileno em Levine EMB Agar tornam o meio ligeiramente seletivo na medida em que inibem gram- bactérias positivas em um grau limitado. Essas tinturas também desempenham um papel na diferenciação entre fermentadores de lactose e lactose não fermentadores devido à presença ou ausência de absorção de corante em as colônias bacterianas. Coliformes, como organismos fermentadores de lactose, são visualizados como colônias preto-azuladas, enquanto as colônias de Salmonella e Shigella, como não fermentadores de lactose, aparecem incolor, transparente ou âmbar. E. coli apresenta um brilho metálico esverdeado na luz refletida, preto azulado centro na luz transmitida.

Algumas bactérias gram-positivas, como estreptococos fecais, estafilococos e leveduras, irão crescer neste meio e geralmente formam colônias pontuais. Uma série de micro-organismos não patogênicos, bactérias gram-negativas não fermentadoras de lactose crescerão neste meio e deve ser distinguida das cepas patogênicas por meio de testes bioquímicos adicionais.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Esterilizar em autoclave usando um ciclo validado.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

As farmacopeias não apresentam as cepas para Grow Promotion, nesse caso pode-se utilizar os micro-organismos indicados no certificado do fabricante:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 33495

Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhi ATCC 19430

Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhimurium ATCC 14028

Shigella dysenteriae ATCC 9361

Shigella flexneri ATCC 12022

Resultados esperados

Escherichia coli - Grande, preto-azulado, brilho verde metálico

Enterobacter / Klebsiella - Grande, mucóide, preto-azulado

Proteus - Grande, incolor

Salmonela - Grande, incolor

Shigella - Grande, incolor

Bactéria Gram-positiva - Sem crescimento, para crescimento leve

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada. Nem todos os listados acima precisam ser usados. Isso vai depender do método.

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa do micro-organismo de interesse.

Realizar GP em cada novo lote de meio de cultura adquirido pronto para uso ou preparado no laboratório, em paralelo com um meio de cultura previamente aprovado.

Os micro-organismos devem ser rastreáveis de uma Cultura de Coleção de Referência e devem estar em não mais do que 5 passagens da Cultura de Referência. Compare o crescimento no novo meio de cultura com o crescimento no meio previamente aprovado. O crescimento deve ser "comparável“. Não existe na USP a definição de quantidade do que é “comparável” Em paralelo realizar o controle do inóculo em ágar não seletivo: deve haver ≤ 100 UFC. E se não houver lote previamente aprovado? Considere adicionar outros Analistas do Laboratório. Use um número significativo de replicatas. A média das médias pode ser considerada como ponto de referência. Essas recomendações servem para a promoção de crescimento de qualquer meio.

Fontes:

United States Pharmacopeia 43ª ed. 2020

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019