R2A ágar

 

Indicação de uso

O Ágar R2A foi desenvolvido por Reasoner e Geldreich para contagens bacteriológicas em placas de água potável tratada. Um meio com composição de baixo nutrientes, como R2A Agar, em combinação com uma menor temperatura e maior tempo de incubação estimulam o crescimento de bactérias estressadas e tolerantes ao cloro. Meios nutricionalmente ricos, como Plate Count Agar (PCA), apoiam o crescimento de bactérias de crescimento rápido, mas podem suprimir bactérias de crescimento lento ou estressadas encontradas em água. Quando o R2A é comparado com meios nutricionalmente ricos, foi relatado que este meio melhora a recuperação de bactérias estressadas e bactérias tolerantes ao cloro de sistemas de água potável. O ágar R2A é recomendado em métodos padrão para contagem pela técnica de pour plate, spread plate e filtração de membrana para contagem de bactérias heterotróficas em placas. É o meio indicado no Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, citado na farmacopeia americana e farmacopeia brasileira como opção de ágar para contagem em água.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• Peptona (caseína ou tecido animal) - 0,5 g
• Ácido Casamino - 0,5g
• Extrato de Levedura - 0,5g
• Piruvato de Sódio - 0,3g
• Glicose (dextrose) - 0,5 g
• Sulfato de Magnésio heptahidratado - 0,05 g
• Amido solúvel - 0,5g
• Fosfato de Hidrogênio Dipotássico - 0,3 g
• Ágar - 15,0 g

O extrato de levedura fornece uma fonte de oligoelementos e vitaminas.

Peptona e o ácido casamino fornecem nitrogênio, vitaminas, aminoácidos ácidos, carbono e minerais. A glicose ou dextrose serve como fonte de carbono.

O amido solúvel auxilia na recuperação de organismos injuriados, absorvendo subprodutos metabólicos tóxicos. Piruvato de sódio aumenta a recuperação de células estressadas. O fosfato de potássio é usado para equilibrar o pH e fornecer fosfato. O sulfato de magnésio é uma fonte de cátions divalentes e sulfato. Agar é o agente solidificante

pH 7,2 ± 0,1. Esterilizar em autoclave usando ciclo validado.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante.

Limitações do Procedimento

O Ágar R2A destina-se a ser utilizado apenas com água potável tratada uma vez que é recomendado para bactérias comprometidas.

O uso do método de pour plate é desencorajado porque recuperação de bactérias estressadas pode ser comprometida pelo choque térmico (44-46°C) e baixa tensão de oxigênio que fazem parte do procedimento.

Pode ser necessário um tempo de incubação superior ao indicado para recuperar bactérias adicionais de crescimento lento.

O Ágar R2A tem melhor desempenho com a técnica de espalhamento em placa; no entanto, esse procedimento é limitado a um pequeno volume de amostra.

Bactérias de crescimento rápido podem produzir colônias menores no R2A Agar do que em meios nutricionalmente ricos.

O Ágar R2A é um meio com baixo teor de nutrientes destinado ao cultivo micro-organismos comprometidos. Bom crescimento do padrão, organismos de controle saudáveis ​​não reflete necessariamente a capacidade do meio de recuperar organismos estressados. Cada novo lote de meio deve ser testado em termos de desempenho contra um lote anterior de ágar R2A usando água potável.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

As farmacopeias não apresentam as cepas para Grow Promotion, nesse caso pode-se utilizar os micro-organismos indicados no certificado do fabricante:

Para promoção de crescimento

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Escherichia coli ATCC 25922

Pseudomonas aerginosa ATCC 27853

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa do micro-organismo de interesse.

Realizar GP em cada novo lote de meio de cultura adquirido pronto para uso ou preparado no laboratório, em paralelo com um meio de cultura previamente aprovado.

Os micro-organismos devem ser rastreáveis de uma Cultura de Coleção de Referência e devem estar em não mais do que 5 passagens da Cultura de Referência. Compare o crescimento no novo meio de cultura com o crescimento no meio previamente aprovado. O crescimento deve ser "comparável“. Não existe na USP a definição de quantidade do que é “comparável” Em paralelo realizar o controle do inóculo em ágar não seletivo: deve haver ≤ 100 UFC. E se não houver lote previamente aprovado? Considere adicionar outros Analistas do Laboratório. Use um número significativo de replicatas. A média das médias pode ser considerada como ponto de referência. Essas recomendações servem para a promoção de crescimento de qualquer meio.

Fontes:

United States Pharmacopeia 43ª ed. 2020

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 23ª ed.