Fluid Thioglycollate Medium

Indicação de uso

O meio Fluid Thioglycollate Medium, também conhecido como Meio Fluído de Tioglicolato é um meio de utilização geral para cultura de anaeróbios, microaerófilos e aeróbios, e é recomendado como um dos meios de teste da esterilidade em produtos farmacêuticos pelas farmacopeias americana e brasileira, bem como a europeia e japonesa. É recomendado no Manual Analítico Bacteriológico (BAM) do FDA e Official Methods of Analysis of AOAC International para a análise de alimentos e para determinar o coeficiente de fenol e efeitos esporicidas de desinfetantes.

Quastel e Stephenson descobriram que a presença de uma pequena quantidade de um composto contendo um grupo –SH (cisteína, ácido tioglicólico, glutationa) permitiu o crescimento "aeróbico" de Clostridium sporogenes em caldo de digestão tríptico.

Falk, Bucca e Simmons apontaram as vantagens de usar pequenas quantidades de ágar (0,06-0,25%) na detecção contaminantes durante testes de esterilidade de produtos biológicos. O valor de combinar uma pequena quantidade de ágar e uma substância redutora foi demonstrado por Brewer. Os experimentos de Brewer revelaram que em meio líquido contendo 0,05% de ágar, os micro-organismos anaeróbios cresceram igualmente bem na presença ou ausência de tioglicolato de sódio. Marshall, Gunnish e Luxen relataram resultados satisfatórios sobre cultivo de anaeróbios no meio de tioglicolato de Brewer na presença de um conservante mercurial. Nungester, Hood e Warren e Portwood confirmaram a neutralização de o efeito bacteriostático de compostos mercuriais pelo tioglicolato de sódio. A incorporação de peptona caseína foi introduzida por Vera. Malin e Finn relataram que o meio comumente usado contendo tioglicolato é inibitório para alguns organismos da presença de carboidratos. Em 1941, o National Institutes of Health especificou o uso de dois meios de tioglicolato em testes de esterilidade, a Fórmula Brewer e a Fórmula Linden. A Fórmula Linden foi posteriormente denominada Modified Brewer Thioglycollate Medium no qual a infusão de carne foi substituída por peptonas vegetais (soja).

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Digerido pancreático de caseína - 15,0 g
• L-cistina - 0,5 g
• Dextrose - 5,5 g
• Extrato de leveduras - 5,0 g
• Cloreto de sódio - 2,5 g
• Tioglicolato de sódio- 0,5 g
• Resazurina - 0,001 g
• Ágar - 0,75 g 

O pH final é 7.1 ± 0.2

A dextrose, a peptona, a L-cistina e o extrato de leveduras proporcionam os fatores de crescimento necessários para a replicação bacteriana. O cloreto de sódio fornece mantem o equilíbrio osmótico. O tioglicolato de sódio é um agente redutor que mantém uma baixa tensão de oxigênio removendo o oxigênio molecular do ambiente, isto é, cria condições anaeróbicas quando reduz o oxigênio molecular à água. Peróxidos, que podem ser letais para muitos organismos anaeróbicos, não são formados sob essa condição. A L-cistina também é um agente redutor, uma vez que contém grupos sulfidrila que inativam os compostos de metais pesados e mantêm um potencial de oxidação-redução baixo, suportando assim a anaerobiose. A resazurina é um indicador de oxidação-redução que fica cor-de-rosa quando é oxidado e transparente quando é reduzido. A adição de uma pequena quantidade de ágar no meio tioglicolato ajuda no início e no crescimento de pequenos inóculos e anaeróbios, impedindo a difusão de oxigênio no meio. Também retarda a dispersão de CO₂ e a substância redutora do microambiente ao redor do inóculo.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

Nos casos em que os meios de cultura são utilizados para o teste de esterilidade de penicilinas e cefalosporinas pelo método de inoculação direta, a preparação do Meio fluido de tioglicolato deve ser modificada conforme descrito a seguir: Transferir, assepticamente, para os frascos esterilizados, contendo cada meio quantidade de β-lactamase suficiente para inativar o antibiótico presente na amostra.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Os compêndios trazem uma lista com os microrganismos a serem inoculados para o teste de grow promotion (também conhecido como teste de promoção de crescimento ou capacidade nutritiva dos meios de cultura). Outros micro-organismos, como cepas in house podem ser inoculados também de modo a comprovar a capacidade do meio de recuperar os mesmos. Inocular menos que 100 UFC do micro-organismo teste ao meio. Incubar à temperatura adequada e observar o crescimento visível comparando com um controle (branco) do mesmo meio de cultura.

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de micro-organismos.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Tioglicolato Fluido são:

Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCTC 10788, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276, INCQS 00039

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275, INCQS 00230

Clostridium sporogenes ATCC 19404, NCTC 532, CIP 79.3, INCQS 00352 ou ATCC 11437, NCIMB 14239, CIP 100651, NBRC 14293

Bacteroides vulgatus (ATCC 8482, NCTC 11154, INCQS 00059) pode ser utilizado alternativamente a Clostridium sporogenes, quando não for necessário o uso de um micro-organismo esporulado.

Uma alternativa a Staphylococcus aureus é o Bacillus subtilis (INCQS 00001, ATCC 6633, CIP 52.62, NBRC 3134, NCIMB 8054, NCTC 10400).

Um micro-organismo alternativo para Pseudomonas aeruginosa é a Kocuria rhizophila (INCQS 00010, ATCC 9341, CIP 53.65, NCTC 8340).

O teste de promoção de crescimento é considerado válido se houver evidência de crescimento microbiano, visualizado pela turvação e/ou por métodos microscópicos, após três dias de incubação dos meios inoculados com bactérias. Aeróbicos estritos crescerão apenas na faixa rosa, Os microaerófilos crescerão perto do fundo da banda, onde a concentração de oxigênio é menor. Os anaeróbios facultativos e os anaeróbios aerotolerantes crescerão por todo o tubo. Os anaeróbios facultativos crescem em todo o meio, mas mais concentrados na parte inferior e os aeróbios facultativos crescem por toda a parte, mas mais no topo. O facultativo cresce mais densamente onde o oxigênio está presente.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019

Columbia Agar Base

Indicação de uso

O meio Columbia Agar Base, também conhecido como Columbia Agar ou Agar Columbia, com ou sem a adição de 5% (ou 10%) de sangue de ovelha, é um meio altamente nutritivo de uso geral utilizado para o isolamento e cultura de micro-organismos não exigentes e exigentes provenientes de amostras clínicas, e pesquisa de Clostridium em amostras de cosméticos, produtos descartáveis e produtos farmacêuticos. Está em conformidade com a Farmacopeia Brasileira (FB), Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), Farmacopeia Europeia (EP) e Farmacopeia Japonesa (JP).

Ellner et al., em 1966, relataram o desenvolvimento de um formulação de agar, que foi designada como Columbia Agar. A base alcança o crescimento mais rápido e exuberante obtido a partir de hidrolisado de caseína com melhor definição de reações hemolíticas, morfologia colonial mais típica e melhor produção de pigmento alcançada com meios contendo infusão de peptona.

O Columbia Agar Base é utilizado como base para meios contendo sangue e para formulações seletivas de meios em que várias combinações de agentes antimicrobianos são usadas como aditivos.

O Columbia Agar está listado como o único meio recomendado para o isolamento de Clostridium sp em produtos farmacêuticos não estéreis.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Hidrolisado de pancreático de caseína - 10,0 g
• Peptona de carne digestão - 5,0 g
• Digesto pancreático de coração - 3,0 g
• Extrato de levedura - 5,0 g
• Amido de milho - 1,0 g
• Cloreto de sódio - 5,0 g
• Ágar, de acordo com o poder gelificante - 10,0 - 15,0 g 

O pH final é 7.3 ± 0.2

As propriedades para suportar um crescimento superior do ágar Columbia derivam da combinação de duas peptonas com extrato de levedura como uma fonte de vitaminas de complexo B. O amido fornece uma fonte de carbono e o cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. O amido de milho também tem a função de absorver os subprodutos tóxicos contidos nas amostras e funciona como uma fonte de energia para os organismos que possuem alfa-amilases. O Agar é o agente solidificante.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Esterilizar em autoclave usando ciclo validado. Esfriar para 45 °C a 50 °C e adicionar, se necessário, sulfato de gentamicina correspondente a 20 mg de gentamicina base, verter em placas de Petri.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

Os micro-organismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Columbia Agar são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Clostridium sporogenes ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) ou ATCC 19404 (NCTC 532 ou CIP 79.3).

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura, condições e tempo especificados no ensaio de pesquisa Clostridium.

O crescimento de colônias catalase negativas, com micromorfologia de bacilo Gram positivo (com ou sem endósporos) indica presença provável de Clostridium.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019

Endotoxinas bacterianas - Realização das Análises

Olá caros colegas, quebrando um pouco a sequência de posts sobre meios de cultura, publico esse sobre Endotoxinas. Esse texto foi elaborado pela minha grande amiga Janaina Fernandes, Bióloga e Farmacêutica que tem um vasto conhecimento sobre o assunto.

Abaixo, estaremos falando dos detalhes da realização dos ensaios para avaliação de endotoxinas bacterianas.  Independente da farmacopeia ou protocolo a ser utilizado, os cuidados serão os mesmos.

Materiais

Obrigatoriamente, os materiais utilizados para a realização deste ensaio devem ser apirogênicos, ou seja, ausente de endotoxinas ou pirogênio.

As ponteiras das micropipetas, os frascos para diluição, os tubos para analise ou preparo da curva de calibração, a água para diluição das amostras, buffer, pinça para pesagem, tudo deve ser apirogênico.

Isso é uma condição essencial para que o resultado seja confiável e correto.

Para tal, os materiais podem ser comprados nessas condições ou no caso dos vidros e metais, podem ser despirogenizados in loco. Existem diversas técnicas para despirogenização, sendo o calor seco, a técnica mais utilizada. Para que seja eficaz, a estufa deve ser qualificada e validada segundo preconiza as farmacopeias. Sempre que for despirogenizado material, deve ser feito o monitoramento dos lotes com padrões específicos (vials) que podem ser adquiridos no mesmo fornecedor do lisado ou verificar conforme procedimentos internos.

Ambiente

Preciso trabalhar num ambiente estéril para fazer a analise de endotoxinas bacterianas?

Não é necessário fazer as diluições ou a analise em ambiente estéril, somente limpo.

É obrigatório fazer as diluições ou manipulação do lisado em fluxo laminar? Por quê?

Não, tudo pode ser feito em bancadas previamente limpas, porque a analise verifica a presença de endotoxinas que somente é liberada para o produto pós-processo de esterilização, ou seja, com a morte de bactérias gram-negativas, na maioria das vezes.

Como fazer as diluições

Como fazer as diluições é uma dúvida extremamente comum.

Para a análise de endotoxinas bacterianas, trabalhamos com volumes muito pequenos. Para fazer as diluições calculadas ou validadas, utilizamos micropipetas. Existem diversas marcas no mercado. Para tal, devem-se adquirir equipamentos confiáveis, com boa precisão e poucos erros. Dependendo da sua rotina de análises e diluições a serem realizadas, podem-se utilizar micropipetas de volume fixo ou de volume variável. Quando há a necessidade de preparo de volumes maiores de 10mL, pode-se fazer uso de pipetas apirogênicas ou pipetas automáticas de volumes variados ou fixos.

Observação: para o preparo das diluições devemos fazer uso de materiais apirogênicos, ou seja, com ausência de pirogênio ou endotoxinas conforme já descrito nos itens anteriores.

Na rotina, fazemos diluições de varias formas, uma delas é a seriada.

Como o próprio nome já diz, são diluições que fazemos em série. Como assim? Fazemos uma sequencia de diluições onde uma é parte integrante da outra.

Observação: Para manter a exatidão e reduzir os possíveis erros, utilizamos sempre a mesma micropipeta ou outras para volumes menores em menor quantidade de vezes possível.

Exemplo: Como eu faço uma diluição 1:120?

Dependendo do volume final que você irá preparar, faça a separação dos equipamentos e materiais necessários. No caso aqui, será o preparo de 1mL de volume final. Lembre-se que para a analise de endotoxinas, normalmente utilizamos volumes inferiores a 1mL (quando temos o produto ou matéria-prima já em rotina).

Pra quem não gostava das aulas de matemática na escola, sinto dizer, mas vão colocar em prática muitas das coisas que achava que nunca usaria, como raciocínio lógico, por exemplo.

Neste caso, serão utilizadas micropipetas de volume variável.

Diluição 1:12 é a mesma coisa que 1+11, ou seja, 1mL do produto inicial + 11mL de água apirogênica, como 12mL de volume final é muito desperdício de material, trabalharemos com volume menor, portanto, 10x menor. Nesse caso utilizamos 0,1mL do produto inicial + 1,1mL de água apirogênica na primeira diluição. Como estamos falando em 1:120, temos que fazer uma segunda diluição 1:10.

Mas por que 1:10?

Porque quando fazemos diluições seriadas estamos trabalhando com múltiplos. Portanto, fizemos uma primeira diluição 1:12 e a segunda 1:10, assim 12 x 10 = 120.

Nesse caso, como eu quero preparar somente 1mL de volume final, para não ter desperdício, fiz a diluição trabalhando com proporções. 1:12 é a mesma coisa que 0,1:1,2

Se fosse 1:288, como poderíamos fazer?

Primeiro faremos diluição 1:12 e depois pegamos 1mL da solução anterior e fazemos a diluição 1:24

Se fosse 1:100? Quero preparar 1mL, vou usar 0,01mL do produto mais 0,99mL de água apirogênica, ou seja, 10mL do produto mais 990mL de água apirogênica ou 2 diluições seriadas 1:10, onde 10x10 = 100.

Caso tenham dúvidas, deixem nos comentários que eu encaminho para Janaina.

Até o próximo post!