Endotoxinas bacterianas - Realização das Análises

Olá caros colegas, quebrando um pouco a sequência de posts sobre meios de cultura, publico esse sobre Endotoxinas. Esse texto foi elaborado pela minha grande amiga Janaina Fernandes, Bióloga e Farmacêutica que tem um vasto conhecimento sobre o assunto.

Abaixo, estaremos falando dos detalhes da realização dos ensaios para avaliação de endotoxinas bacterianas.  Independente da farmacopeia ou protocolo a ser utilizado, os cuidados serão os mesmos.

Materiais

Obrigatoriamente, os materiais utilizados para a realização deste ensaio devem ser apirogênicos, ou seja, ausente de endotoxinas ou pirogênio.

As ponteiras das micropipetas, os frascos para diluição, os tubos para analise ou preparo da curva de calibração, a água para diluição das amostras, buffer, pinça para pesagem, tudo deve ser apirogênico.

Isso é uma condição essencial para que o resultado seja confiável e correto.

Para tal, os materiais podem ser comprados nessas condições ou no caso dos vidros e metais, podem ser despirogenizados in loco. Existem diversas técnicas para despirogenização, sendo o calor seco, a técnica mais utilizada. Para que seja eficaz, a estufa deve ser qualificada e validada segundo preconiza as farmacopeias. Sempre que for despirogenizado material, deve ser feito o monitoramento dos lotes com padrões específicos (vials) que podem ser adquiridos no mesmo fornecedor do lisado ou verificar conforme procedimentos internos.

Ambiente

Preciso trabalhar num ambiente estéril para fazer a analise de endotoxinas bacterianas?

Não é necessário fazer as diluições ou a analise em ambiente estéril, somente limpo.

É obrigatório fazer as diluições ou manipulação do lisado em fluxo laminar? Por quê?

Não, tudo pode ser feito em bancadas previamente limpas, porque a analise verifica a presença de endotoxinas que somente é liberada para o produto pós-processo de esterilização, ou seja, com a morte de bactérias gram-negativas, na maioria das vezes.

Como fazer as diluições

Como fazer as diluições é uma dúvida extremamente comum.

Para a análise de endotoxinas bacterianas, trabalhamos com volumes muito pequenos. Para fazer as diluições calculadas ou validadas, utilizamos micropipetas. Existem diversas marcas no mercado. Para tal, devem-se adquirir equipamentos confiáveis, com boa precisão e poucos erros. Dependendo da sua rotina de análises e diluições a serem realizadas, podem-se utilizar micropipetas de volume fixo ou de volume variável. Quando há a necessidade de preparo de volumes maiores de 10mL, pode-se fazer uso de pipetas apirogênicas ou pipetas automáticas de volumes variados ou fixos.

Observação: para o preparo das diluições devemos fazer uso de materiais apirogênicos, ou seja, com ausência de pirogênio ou endotoxinas conforme já descrito nos itens anteriores.

Na rotina, fazemos diluições de varias formas, uma delas é a seriada.

Como o próprio nome já diz, são diluições que fazemos em série. Como assim? Fazemos uma sequencia de diluições onde uma é parte integrante da outra.

Observação: Para manter a exatidão e reduzir os possíveis erros, utilizamos sempre a mesma micropipeta ou outras para volumes menores em menor quantidade de vezes possível.

Exemplo: Como eu faço uma diluição 1:120?

Dependendo do volume final que você irá preparar, faça a separação dos equipamentos e materiais necessários. No caso aqui, será o preparo de 1mL de volume final. Lembre-se que para a analise de endotoxinas, normalmente utilizamos volumes inferiores a 1mL (quando temos o produto ou matéria-prima já em rotina).

Pra quem não gostava das aulas de matemática na escola, sinto dizer, mas vão colocar em prática muitas das coisas que achava que nunca usaria, como raciocínio lógico, por exemplo.

Neste caso, serão utilizadas micropipetas de volume variável.

Diluição 1:12 é a mesma coisa que 1+11, ou seja, 1mL do produto inicial + 11mL de água apirogênica, como 12mL de volume final é muito desperdício de material, trabalharemos com volume menor, portanto, 10x menor. Nesse caso utilizamos 0,1mL do produto inicial + 1,1mL de água apirogênica na primeira diluição. Como estamos falando em 1:120, temos que fazer uma segunda diluição 1:10.

Mas por que 1:10?

Porque quando fazemos diluições seriadas estamos trabalhando com múltiplos. Portanto, fizemos uma primeira diluição 1:12 e a segunda 1:10, assim 12 x 10 = 120.

Nesse caso, como eu quero preparar somente 1mL de volume final, para não ter desperdício, fiz a diluição trabalhando com proporções. 1:12 é a mesma coisa que 0,1:1,2

Se fosse 1:288, como poderíamos fazer?

Primeiro faremos diluição 1:12 e depois pegamos 1mL da solução anterior e fazemos a diluição 1:24

Se fosse 1:100? Quero preparar 1mL, vou usar 0,01mL do produto mais 0,99mL de água apirogênica, ou seja, 10mL do produto mais 990mL de água apirogênica ou 2 diluições seriadas 1:10, onde 10x10 = 100.

Caso tenham dúvidas, deixem nos comentários que eu encaminho para Janaina.

Até o próximo post!