Tryptic Soy Broth (TSB)

Indicação de uso

O meio TSB – Tryptic Soy Broth, também conhecido como Soybean-Casein Digest Broth, Caldo Caseína Soja ou Caldo Digestão Enzimática de Caseína-Soja é o meio de escolha dos métodos farmacopeicos para diversos ensaios, tais como Teste de Esterilidade, Contagem de Microrganismos Mesofílicos (também chamado de Bioburden em alguns laboratórios), pesquisa de patógenos em diversos seguimentos, como indústria farmacêutica, cosmética, alimentos etc. Pode ser usado como meio enriquecedor para recuperação de micro-organismos para isolamento e identificação.

Em testes de Media Fill, é o meio de escolha para substituir o produto, de modo a simular operações assépticas para assegurar que os processos utilizados são capazes de produzir produtos estéreis.  

O TSB foi escolhido pela USDA Animal and Plant Health Inspection Service para detecção de bactérias viáveis em vacinas vivas.

Devido à sua capacidade de promoção de crescimento, o TSB também é recomendado para uso como caldo de inóculo para difusão de disco e ágar teste de sensibilidade antimicrobiana por diluição, conforme Instituto de Normas Clínicas e Laboratoriais (CLSI).

TSB é um meio nutritivo que permite o crescimento de uma ampla variedade de micro-organismos, incluindo bactérias aeróbicas, facultativas e anaeróbicas comuns e fungos.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Peptona de caseína pancreática – 17 g
• Farinha de soja obtida por digestão papaínica - 3 g
• Cloreto de Sódio - 5 g
• Fosfato de Potássio Dibásico – 2,5 g
• Dextrose – 2,5 g 

Digestões enzimáticas de caseína e soja fornecem aminoácidos e outras substâncias nitrogenadas complexas. Dextrose é uma fonte de energia. Cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. O fosfato de potássio dibásico age como um tampão para controlar o pH.

O pH final é 7.3 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

Algumas modificações na formulação permitem diversificar o uso deste meio tão versátil. A adição de 6,5% de cloreto de sódio ao TSB permite a diferenciação de enterococos tolerantes ao sal, que são resistentes ao alto teor de sal, da intolerância ao sal do grupo S. bovis e outras espécies de estreptococos. Nesta concentração, o cloreto de sódio é um agente seletivo que interfere com permeabilidade de membrana osmótica e equilíbrio eletrocinético. Fildes Enrichment é uma digestão péptica de sangue de ovelha que fornece o X (heminina) e V (dinucleotídeo de nicotinamida adenina, NAD) fatores necessários para o crescimento de H. influenzae. A dextrose é omitida da fórmula do TSB para permitir o uso do meio em estudos de fermentação. A concentração de carboidratos usada com mais frequência nas reações de fermentação é de 0,5% ou 1%.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Os compêndios trazem uma lista com os microrganismos a serem inoculados para o teste de grow promotion (também conhecido como teste de promoção de crescimento ou capacidade nutritiva dos meios de cultura). Outros micro-organismos, como cepas in house podem ser inoculados também de modo a comprovar a capacidade do meio de recuperar os mesmos. Inocular menos que 100 UFC do micro-organismo teste ao meio. Incubar à temperatura adequada e observar o crescimento visível comparando com um controle (branco) do mesmo meio de cultura.

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de micro-organismos.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em TSB são: 

• Staphylococcus aureus ATCC 6538;
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027;
• Bacillus subtilis ATCC 6633;
• Candida albicans ATCC 10231;
• Aspergillus brasiliensis ATCC 16404.

Após inoculação, as condições de incubação para bactérias são temperatura de 30 à 35ºC por 18-24 horas, para fungos, a temperatura é de 20º a 25ºC por 2-5 dias. As cepas de B. subtilis, C. albicans e A. brasiliensis são usadas para avaliar o TSB preparado para o ensaio de esterilidade.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Tryptic Soy Agar (TSA)

Indicação de uso

O meio TSA – Tryptic Soy Agar, também conhecido como Soybean-Casein Digest Agar, Agar Caseína Soja ou Ágar Digestão Enzimática de Caseína-Soja é o meio de escolha dos métodos farmacopeicos para o ensaio de Contagem do número total de micro-organismos Mesofílicos (também chamado de Bioburden em alguns laboratórios) em diversos seguimentos, como industria farmacêutica, cosmética, alimentos etc. Também é utilizado para monitoramento ambiental, e embora seja mais indicado para o crescimento de bactérias, tem sido muito usado para detecção de fungos em ambientes controlados, bastando incubar em temperatura ideal para o crescimento de bolores e leveduras. Pode ser utilizado como meio de manutenção de cepas bacterianas e para isolamento de bactérias, para uma identificação posterior.

TSA é usado para o isolamento e cultivo de micro-organismos não fastidiosos e fastidiosos, mas não é o meio de escolha para anaeróbios.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• Peptona de caseína pancreática – 15 g
• Farinha de soja obtida por digestão papaínica - 5 g
• Cloreto de Sódio - 5 g
• Agar - 15 g

A combinação de caseína e peptonas de soja em TSA torna o meio altamente nutritivo, fornecendo nitrogênio orgânico, particularmente aminoácidos e peptídios de cadeia mais longa. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. Agar é o agente solidificante.

O pH final é 7.3 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

No preparo em laboratório, outros constituintes podem ser acrescentados à preparação deste meio, de modo à adequá-lo para seus diversos usos. Para análises clinicas, é usado sangue de ovelha a 5%. Placas para monitoramento ambiental podem vir acrescidas de inativantes para os princípios ativos do saneantes mais usados para limpeza e sanitização dos ambientes de laboratório e planta de fábrica. Para análises em produtos acabados, recomenda-se a adição de agentes neutralizantes adequados ao tipo de conservante.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Os compêndios trazem uma lista com os micro-organismos a serem inoculados para o teste de grow promotion (também conhecido como teste de promoção de crescimento ou capacidade nutritiva dos meios de cultura). Outros micro-organismos, como cepas in house podem ser inoculadas também de modo a comprovar a capacidade do meio de recuperar os mesmos. Uma suspensão com não mais do que 100 UFC deve ser inoculada no meio. Para ser considerado aprovado, a Farmacopeia Americana recomenda que o crescimento obtido não deve diferir por um fator maior que 2 do valor calculado para um inóculo. Já a Farmacopeia Brasileira diz que o crescimento obtido que não deve ser inferior a 50% em relação ao inóculo padronizado. Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de micro-organismos.

Os micro-organismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em TSA são: 

• Staphylococcus aureus ATCC 6538;
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027;
• Bacillus subtilis ATCC 6633;
• Candida albicans ATCC 10231;
• Aspergillus brasiliensis ATCC 16404. 

Após inoculação, as condições de incubação para bactérias são temperatura de 30 à 35ºC por 18-24 horas, para Candida albicans 20º a 25ºC por 2-3 dias e para Aspergillus brasiliensis 20º a 25ºC por 5-7 dias ou até esporulação evidente.

Alguma dúvida? Deixem seus comentários. Até o próximo post!

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Meios de Cultura – Conceitos Gerais

Caros colegas, com este post darei inicio à uma série de textos sobre os meios de cultura farmacopeicos. Vou tentar esclarecer informações técnicas de cada um, pois acredito que se conhecermos bem a ciência por traz de cada formulação, fica mais fácil a interpretação de resultados, bem como percebermos algum desvio. Sei que no dia a dia do controle de qualidade temos uma série de normas, compêndios e legislações à serem seguidas, mas não devemos nunca esquecer da Microbiologia clássica, afinal, todo bom analista tem um cientista dentro se si.

Outras informações como classificação, preparo e controle de meios estão neste post mais antigo: https://controledequalidadeemindustria.blogspot.com/2016/07/meios-de-cultura.html 

Requisitos de Crescimento de Micro-organismos

O cultivo de microrganismos depende de um número importante de fatores:

Nutrientes adequados devem estar disponíveis. 

• Oxigênio ou outros gases devem estar disponíveis, conforme necessário;
• A umidade é necessária;
• O meio deve ter um pH apropriado;
• As relações de temperatura adequadas devem prevalecer;
• O meio deve estar livre de bioburden interferente;
• A contaminação deve ser evitada. 

Um meio de cultura microbiológico satisfatório deve conter fontes disponíveis de: 

• Carbono;
• Nitrogênio;
• Fosfato inorgânico e enxofre;
• Traço de metais;
• Água;
• Vitaminas.

Estes foram originalmente fornecidos sob a forma de infusão de carne. Extratos de carne ou levedura freqüentemente substituem a infusão de carne em meio de cultura. A adição de peptonas, que são digestos de proteínas, fornece fontes prontamente disponíveis de nitrogênio e carbono.

O pH do meio de cultura é importante para o crescimento microbiano. A temperatura é outro parâmetro importante: bactérias e fungos mesófilos têm crescimento ideal a temperaturas de 25ºC a 40ºC; os organismos termofílicos crescem apenas a temperaturas superiores a 45°C; organismos psicrófilos requerem temperaturas abaixo de 20°C. Organismos patogênicos para os seres humanos são geralmente mesófilos.

Constituintes Comuns dos Meios

Formulações de meios são desenvolvidas sobre a capacidade de bactérias para usar componentes dos mesmos.

Constituintes	Fonte
Amino-Nitrogênio	Peptona, hidrolisado de proteínas, infusões e extratos
Fatores de crescimento	Sangue, soro, extrato de levedura ou vitaminas, NAD
Fontes de energia	Açúcar, álcoois e carboidratos
Sais tamponantes	Fosfatos, acetatos e citratos
Sais minerais e metais	Fosfato, sulfato, magnésio, cálcio, ferro
Agentes seletivos	Químicos, Antimicrobianos e corantes
Corantes indicadores	Vermelho fenol, vermelho neutro
Gelificante	Agar, gelatina, alginato, gel de sílica

Fatores Ambientais nos Meios de Cultura

Atmosfera

A maioria das bactérias é capaz de crescer em condições normais de tensão de oxigênio. Aeróbicos obrigatórios exigem a admissão livre oxigênio, enquanto os anaeróbios crescem apenas na ausência de oxigênio atmosférico. Entre esses dois grupos estão os microaerófilos, que se desenvolvem melhor sob condições parciais anaeróbias, e os anaeróbios facultativos, que são capazes de de crescer na presença ou ausência de oxigênio. Condições anaerobias para o crescimento de microrganismos são obtidas de diversas maneiras: 

• Adição de pequenas quantidades de ágar a meios líquidos;
• Adição de tecido fresco ao meio;
• Adição de uma substância redutora ao meio; por exemplo: tioglicolato de sódio, ácido tioglicólico e L-cistina;
• Deslocamento do ar por hidrogênio ou nitrogênio;
• Absorção do oxigênio por produtos químicos;
• Inoculação nas camadas profundas de meios sólidos ou sob uma camada de óleo em meio líquido.

Muitos micro-organismos requerem um ambiente de 5-10% CO_2. Níveis superiores a 10% são muitas vezes inibitórios devido a diminuição no pH como formas de ácido carbônico. Os meios de cultura variam em sua susceptibilidade para formar produtos de oxidação tóxica se expostos à luz e ar.

Atividade de água

Condições adequadas de umidade são necessárias para a continuidade de crescimento abundante de micro-organismos. Os organismos requerem um ambiente aquoso que deve ter água “livre”. Água “livre” não é limitante em estrutura complexa e é necessário para a transferência de nutrientes e resíduos tóxicos. Evaporação durante a incubação ou armazenamento resulta em perda de água “livre” e redução de tamanho da colônia ou inibição total do crescimento do organismo.

Agentes Protetores e Fatores de Crescimento

Carbonato de cálcio, amido solúvel e carvão são exemplos agentes protetores utilizados nos meios de cultura para neutralizar e absorver metabólitos tóxicos produzidos pelo crescimento bacteriano.

Nicotinamida adenina dinucleotide, NAD (fator V) e hemin (Fator X) são fatores de crescimento requeridos por certas bactérias; por exemplo: espécies de Haemophilus, e para o crescimento aumentado de Neisseria espécies.

Os surfactantes, incluindo o polissorbato 80, diminuem a tensão em torno de bactérias suspensas no meio. Esta atividade permite uma entrada mais rápida dos compostos desejados na célula bacteriana e pode aumentar o crescimento bacteriano.

Cuidados

Os meios de cultura são a base para a maioria dos testes microbiológicos. Proteger a qualidade do meio é, portanto, fundamental para o sucesso do laboratório de microbiologia. A preparação do meio, o armazenamento adequado e os testes de controle de qualidade podem garantir um fornecimento consistente de meio de alta qualidade. É importante escolher o meio ou os componentes corretos ao fazer o meio com base no uso de fontes ou referências aceitas para fórmulas. A fórmula do fabricante e as instruções de preparação acompanham rotineiramente meios desidratados e meios prontos. Como diferentes tipos de meio podem ter diferentes requisitos de preparação (por exemplo, aquecimento, aditivos e ajuste de pH), é importante seguir essas instruções para garantir a preparação de uma qualidade de meio aceitável. Um certificado de análise descrevendo a data de validade e as condições de armazenamento recomendadas acompanha o meio pronto, bem como os organismos de controle de qualidade usados ​​na promoção de crescimento e teste de seletividade desse meio. A água é o diluente universal para meios microbiológicos. Água purificada é mais frequentemente usada para preparação de meios, mas em certos casos, o uso de água deionizada ou destilada pode ser apropriado. Água de qualidade inferior não deve ser usada para preparação de meios microbiológicos. O volume de água usado deve ser registrado. A preparação consistente do meio requer a pesagem precisa do meio desidratado ou dos constituintes do meio. Uma balança calibrada com a faixa de peso apropriada para os ingredientes deve ser usada. Devem ser usados ​​recipientes e ferramentas de pesagem limpos (como espátulas) para evitar que substâncias estranhas entrem na formulação. O peso dos componentes deve ser registrado. Os meios desidratados devem ser completamente dissolvidos em água antes de dispensar e esterilizar. Se o aquecimento for necessário para ajudar a dissolver o meio, deve-se tomar cuidado para não superaquecer o meio, porque todos os meios de cultura, em maior ou menor grau, são sensíveis ao calor. O equipamento usado na preparação do meio deve ser apropriado para permitir o aquecimento controlado, agitação constante e mistura do meio. O escurecimento do meio (reação do tipo Maillard ou escurecimento não enzimático) é uma indicação geral de superaquecimento. Ao adicionar necessário suplementos ao meio, deve ser realizada uma mistura adequada do meio após a adição do suplemento. A preparação do meio em vidrarias mal limpas pode permitir que substâncias inibidoras entrem no meio. As substâncias inibidoras podem ser provenientes de resíduos de detergente após a limpeza do vidro ou de materiais anteriores usados ​​no vidro. Certifique-se de que o processo de limpeza remove detritos e materiais estranhos, e que o detergente é bem enxaguado com Água Purificada.

A esterilização dos meios deve ser realizada dentro dos parâmetros fornecidos pelo fabricante ou validados pelo usuário. Os meios preparados comercialmente devem fornecer documentação do método de esterilização usado. A autoclavagem por calor úmido é a técnica de esterilização preferida, exceto nos casos em que a fervura é necessária para evitar a deterioração dos componentes termolábeis do meio. A esterilização por filtração também pode ser apropriada para algumas formulações. Os efeitos do método e das condições de esterilização no meio devem ser validados por meio de testes de esterilidade e promoção de crescimento do meio. Além disso, se esterilizado por calor úmido, o ciclo de autoclave deve ser validado para garantir a distribuição de calor adequada para cargas e volumes selecionados. Normalmente, os fabricantes recomendam usar um ciclo de autoclave de 121°C por 15 minutos usando uma autoclave validada. Essas condições se aplicam ao tempo na temperatura do meio. Como o tamanho do contêiner e a configuração de carga da autoclave irão influenciar a taxa de aquecimento, ciclos mais longos podem ser necessários para cargas maiores. No entanto, o tempo de esterilização dependerá do volume do meio e da carga da autoclave. Ciclos de esterilização em que a autoclave demora para atingir a temperatura podem resultar em superaquecimento da meio. Portanto, deve-se ter cuidado para validar um ciclo de esterilização, equilibrando a necessidade de meio estéril com a tendência de degradação do meio sob aquecimento excessivo. O armazenamento do meio na autoclave após a conclusão do ciclo do líquido não é recomendado após o resfriamento, pois pode danificar o meio. Condições inadequadas de aquecimento ou esterilização - para meio preparada comercialmente ou internamente - podem resultar em uma diferença na mudança de cor, perda de clareza, força do gel alterada ou desvio de pH da faixa recomendada pelo fabricante, bem como redução da atividade de promoção de crescimento e / ou seletividade. O pH de cada lote de meio deve ser confirmado após o resfriamento à temperatura ambiente (20°–25°C), retirando assepticamente uma amostra para teste. A meio adquirida refrigerada deve aquecer até a temperatura ambiente se for verificada para confirmação do pH. Uma sonda plana de pH é recomendada para superfícies de ágar e uma sonda de imersão é recomendada para líquidos. O pH da meio deve estar em uma faixa de ± 0,2 do valor indicado pelo fabricante, a menos que uma faixa mais ampla seja aceitável pelo método validado.

Os meios preparados devem ser verificados pela inspeção apropriada das placas e tubos para o seguinte:

• Recipientes ou tampas rachados
• Enchimento desigual dos recipientes
• Desidratação resultando em rachaduras ou superfícies onduladas no meio sólido 
• Hemólise
• Escurecimento excessivo ou mudança de cor
• Possível formação de cristais congelamento
• Número excessivo de bolhas
• Contaminação microbiana
• Status dos indicadores redox (se apropriado)
• Número do lote e data de validade verificados e registrados
• Esterilidade do meio
• Limpeza das placas 

Teste de Controle de Qualidade 

Embora os meios de crescimento possam ser preparados em um laboratório a partir de componentes individuais, muitos laboratórios, para facilidade de uso, usam meios desidratados ou adquirem meios preparados comercialmente em placas de plástico ou recipientes de vidro. Os fabricantes de meio tentam padronizar as matérias-primas de fontes biológicas, mas devem lidar constantemente com as diferenças inevitáveis ​​nas matérias-primas obtidas de fontes naturais e, portanto, a variabilidade lote-a-lote da meio deve ser considerada. Além disso, o desempenho do meio preparado em um laboratório ou por um fabricante é altamente dependente das condições de preparação e armazenamento. A preparação inadequada do meio pode causar condições insatisfatórias para o crescimento ou recuperação microbiana e resultados não confiáveis. Portanto, os testes de controle de qualidade devem ser realizados em todos os meios preparados, incluindo meios associados à swabs ou meios em tiras e outros formatos não tradicionais. Os testes realizados rotineiramente em meios preparados internamente devem incluir pH, promoção de crescimento, inibição e propriedades indicativas (conforme apropriado) e verificações de estabilidade periódicas para confirmar a data de validade. Quando os meios microbiológicos preparados internamente são adequadamente preparados e esterilizados usando um método validado, o teste de promoção de crescimento pode ser limitado a cada lote de entrada de meio desidratado, a menos que instruído de outra forma pelo método compendial relevante. Se o procedimento de preparação do meio não foi validado, todos os lotes de meio devem ser submetidos a testes de promoção de crescimento. Os organismos de teste podem ser selecionados no capítulo de teste compendial apropriado. Além disso, os micro-organismos usados ​​em testes de promoção de crescimento podem ser baseados na recomendação do fabricante para um meio específico, ou podem incluir isolados ambientais representativos (mas estes últimos não devem ser interpretados como requisitos compendiais). As datas de expiração na meio devem ter testes de promoção de crescimento de apoio para indicar que o desempenho da meio ainda atende aos critérios de aceitação até e incluindo a data de expiração. A duração da vida útil de um lote de meio dependerá da estabilidade dos ingredientes e da formulação nas condições especificadas, bem como do tipo de recipiente e da tampa. Quando um lote de meio não atende aos requisitos de teste de promoção de crescimento, uma investigação deve ser iniciada para identificar a causa. Essa investigação deve incluir um plano de ação corretiva para prevenir a recorrência do problema. Qualquer lote de meio que falhe no teste de promoção de crescimento é inadequado para uso. [NOTA - Os resultados do teste de promoção de crescimento reprovados não podem ser usados ​​para negar resultados de teste positivos.] Alguns reagentes são usados ​​para fins de diagnóstico para ajudar a apoiar a identificação de organismos microbianos, por exemplo, reagentes de teste de coloração de Gram e oxidase. Eles podem ter atributos que podem ser testados pelo controle de qualidade de maneira semelhante a meios microbiológicos. Selecione os micro-organismos padrão de controle de qualidade corretos, seguindo as instruções do fabricante, e execute os testes de diagnóstico antes da amostra desconhecida. Todos os reagentes de diagnóstico relevantes devem ser submetidos à confirmação de qualidade antes do uso. Deve-se ter cuidado especial com o meio usada em testes de esterilidade e em estudos de monitoramento ambiental. Os meios usados ​​para o monitoramento ambiental de áreas críticas devem ser preferencialmente embalados duas vezes e esterilizados terminalmente. Se a esterilização terminal não for realizada, a meio deve ser submetida a 100% de pré-incubação e inspeção antes do uso em uma área crítica. [NOTA - O teste de promoção de crescimento para este meio deve ser realizado após o estágio de pré-incubação.] Isso evitará que contaminações estranhas sejam transportadas para ambientes controlados e evitará resultados falso-positivos. Um nível elevado de ágar para placas de contato de superfície deve ser verificado.

Dúvidas, só deixar seu comentário.

Até o próximo post!

  

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia - Capitulo <1117 - MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES