- Oxigênio ou outros gases devem estar disponíveis, conforme necessário;
- A umidade é necessária;
- O meio deve ter um pH apropriado;
- As relações de temperatura adequadas devem prevalecer;
- O meio deve estar livre de bioburden interferente;
- A contaminação deve ser evitada.
- Carbono;
- Nitrogênio;
- Fosfato inorgânico e enxofre;
- Traço de metais;
- Água;
- Vitaminas.
Constituintes
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Fonte
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Amino-
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Peptona, hidrolisado de proteínas, infusões e
extratos
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Fatores de crescimento
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Sangue, soro, extrato de levedura ou vitaminas,
NAD
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Fontes de energia
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Açúcar, álcoois e carboidratos
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Sais tamponantes
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Fosfatos, acetatos e citratos
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Sais minerais e metais
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Fosfato, sulfato, magnésio, cálcio, ferro
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Agentes seletivos
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Químicos, Antimicrobianos e corantes
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Corantes indicadores
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Vermelho fenol, vermelho neutro
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Gelificante
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Agar, gelatina, alginato, gel de sílica
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- Adição de pequenas quantidades de ágar a meios líquidos;
- Adição de tecido fresco ao meio;
- Adição de uma substância redutora ao meio; por exemplo: tioglicolato de sódio, ácido tioglicólico e L-cistina;
- Deslocamento do ar por hidrogênio ou nitrogênio;
- Absorção do oxigênio por produtos químicos;
- Inoculação nas camadas profundas de meios sólidos ou sob uma camada de óleo em meio líquido.
Cuidados
Os meios de cultura são a base para a maioria dos testes microbiológicos. Proteger a qualidade do meio é, portanto, fundamental para o sucesso do laboratório de microbiologia. A preparação do meio, o armazenamento adequado e os testes de controle de qualidade podem garantir um fornecimento consistente de meio de alta qualidade. É importante escolher o meio ou os componentes corretos ao fazer o meio com base no uso de fontes ou referências aceitas para fórmulas. A fórmula do fabricante e as instruções de preparação acompanham rotineiramente meios desidratados e meios prontos. Como diferentes tipos de meio podem ter diferentes requisitos de preparação (por exemplo, aquecimento, aditivos e ajuste de pH), é importante seguir essas instruções para garantir a preparação de uma qualidade de meio aceitável. Um certificado de análise descrevendo a data de validade e as condições de armazenamento recomendadas acompanha o meio pronto, bem como os organismos de controle de qualidade usados na promoção de crescimento e teste de seletividade desse meio. A água é o diluente universal para meios microbiológicos. Água purificada é mais frequentemente usada para preparação de meios, mas em certos casos, o uso de água deionizada ou destilada pode ser apropriado. Água de qualidade inferior não deve ser usada para preparação de meios microbiológicos. O volume de água usado deve ser registrado. A preparação consistente do meio requer a pesagem precisa do meio desidratado ou dos constituintes do meio. Uma balança calibrada com a faixa de peso apropriada para os ingredientes deve ser usada. Devem ser usados recipientes e ferramentas de pesagem limpos (como espátulas) para evitar que substâncias estranhas entrem na formulação. O peso dos componentes deve ser registrado. Os meios desidratados devem ser completamente dissolvidos em água antes de dispensar e esterilizar. Se o aquecimento for necessário para ajudar a dissolver o meio, deve-se tomar cuidado para não superaquecer o meio, porque todos os meios de cultura, em maior ou menor grau, são sensíveis ao calor. O equipamento usado na preparação do meio deve ser apropriado para permitir o aquecimento controlado, agitação constante e mistura do meio. O escurecimento do meio (reação do tipo Maillard ou escurecimento não enzimático) é uma indicação geral de superaquecimento. Ao adicionar necessário suplementos ao meio, deve ser realizada uma mistura adequada do meio após a adição do suplemento. A preparação do meio em vidrarias mal limpas pode permitir que substâncias inibidoras entrem no meio. As substâncias inibidoras podem ser provenientes de resíduos de detergente após a limpeza do vidro ou de materiais anteriores usados no vidro. Certifique-se de que o processo de limpeza remove detritos e materiais estranhos, e que o detergente é bem enxaguado com Água Purificada.
A esterilização dos meios deve ser realizada dentro dos parâmetros fornecidos pelo fabricante ou validados pelo usuário. Os meios preparados comercialmente devem fornecer documentação do método de esterilização usado. A autoclavagem por calor úmido é a técnica de esterilização preferida, exceto nos casos em que a fervura é necessária para evitar a deterioração dos componentes termolábeis do meio. A esterilização por filtração também pode ser apropriada para algumas formulações. Os efeitos do método e das condições de esterilização no meio devem ser validados por meio de testes de esterilidade e promoção de crescimento do meio. Além disso, se esterilizado por calor úmido, o ciclo de autoclave deve ser validado para garantir a distribuição de calor adequada para cargas e volumes selecionados. Normalmente, os fabricantes recomendam usar um ciclo de autoclave de 121°C por 15 minutos usando uma autoclave validada. Essas condições se aplicam ao tempo na temperatura do meio. Como o tamanho do contêiner e a configuração de carga da autoclave irão influenciar a taxa de aquecimento, ciclos mais longos podem ser necessários para cargas maiores. No entanto, o tempo de esterilização dependerá do volume do meio e da carga da autoclave. Ciclos de esterilização em que a autoclave demora para atingir a temperatura podem resultar em superaquecimento da meio. Portanto, deve-se ter cuidado para validar um ciclo de esterilização, equilibrando a necessidade de meio estéril com a tendência de degradação do meio sob aquecimento excessivo. O armazenamento do meio na autoclave após a conclusão do ciclo do líquido não é recomendado após o resfriamento, pois pode danificar o meio. Condições inadequadas de aquecimento ou esterilização - para meio preparada comercialmente ou internamente - podem resultar em uma diferença na mudança de cor, perda de clareza, força do gel alterada ou desvio de pH da faixa recomendada pelo fabricante, bem como redução da atividade de promoção de crescimento e / ou seletividade. O pH de cada lote de meio deve ser confirmado após o resfriamento à temperatura ambiente (20°–25°C), retirando assepticamente uma amostra para teste. A meio adquirida refrigerada deve aquecer até a temperatura ambiente se for verificada para confirmação do pH. Uma sonda plana de pH é recomendada para superfícies de ágar e uma sonda de imersão é recomendada para líquidos. O pH da meio deve estar em uma faixa de ± 0,2 do valor indicado pelo fabricante, a menos que uma faixa mais ampla seja aceitável pelo método validado.
Os meios preparados devem ser
verificados pela inspeção apropriada das placas e tubos para o seguinte:
- Recipientes ou tampas rachados
- Enchimento desigual dos recipientes
- Desidratação resultando em rachaduras ou superfícies onduladas no meio sólido
- Hemólise
- Escurecimento excessivo ou mudança de cor
- Possível formação de cristais congelamento
- Número excessivo de bolhas
- Contaminação microbiana
- Status dos indicadores redox (se apropriado)
- Número do lote e data de validade verificados e registrados
- Esterilidade do meio
- Limpeza das placas
Teste de Controle de Qualidade
Embora os meios de crescimento
possam ser preparados em um laboratório a partir de componentes individuais,
muitos laboratórios, para facilidade de uso, usam meios desidratados ou
adquirem meios preparados comercialmente em placas de plástico ou recipientes
de vidro. Os fabricantes de meio tentam padronizar as matérias-primas de fontes
biológicas, mas devem lidar constantemente com as diferenças inevitáveis nas
matérias-primas
obtidas de fontes naturais e, portanto, a variabilidade lote-a-lote da meio
deve ser considerada. Além
disso, o desempenho do meio preparado em um laboratório ou por
um fabricante é
altamente dependente das condições
de preparação e armazenamento. A preparação inadequada do meio pode causar
condições insatisfatórias para o crescimento ou recuperação microbiana e
resultados não confiáveis. Portanto, os testes de controle de qualidade devem
ser realizados em todos os meios preparados, incluindo meios associados à swabs
ou meios em tiras e outros formatos não tradicionais. Os testes realizados
rotineiramente em meios preparados internamente devem incluir pH, promoção de
crescimento, inibição e propriedades indicativas (conforme apropriado) e
verificações de estabilidade periódicas para confirmar a data de validade.
Quando os meios microbiológicos preparados internamente são adequadamente
preparados e esterilizados usando um método validado, o teste de promoção de
crescimento pode ser limitado a cada lote de entrada de meio desidratado, a
menos que instruído de outra forma pelo método compendial relevante. Se o
procedimento de preparação do meio não foi validado, todos os lotes de meio
devem ser submetidos a testes de promoção de crescimento. Os organismos de
teste podem ser selecionados no capítulo de teste compendial apropriado. Além
disso, os micro-organismos usados em
testes de promoção
de crescimento podem ser baseados na recomendação do
fabricante para um meio específico,
ou podem incluir isolados ambientais representativos (mas estes últimos não
devem ser interpretados como requisitos compendiais). As datas de expiração na meio
devem ter testes de promoção de crescimento de apoio para indicar que o
desempenho da meio ainda atende aos critérios de aceitação até e incluindo a
data de expiração. A duração da vida útil de um lote de meio dependerá da
estabilidade dos ingredientes e da formulação nas condições especificadas, bem
como do tipo de recipiente e da tampa. Quando um lote de meio não atende aos
requisitos de teste de promoção de crescimento, uma investigação deve ser
iniciada para identificar a causa. Essa investigação deve incluir um plano de
ação corretiva para prevenir a recorrência do problema. Qualquer lote de meio
que falhe no teste de promoção de crescimento é inadequado para uso. [NOTA - Os
resultados do teste de promoção de crescimento reprovados não podem ser usados para
negar resultados de teste positivos.] Alguns reagentes são usados para
fins de diagnóstico para ajudar a apoiar a identificação de organismos
microbianos, por exemplo, reagentes de teste de coloração de Gram e oxidase.
Eles podem ter atributos que podem ser testados pelo controle de qualidade de
maneira semelhante a meios microbiológicos. Selecione os micro-organismos
padrão de controle de qualidade corretos, seguindo as instruções do fabricante,
e execute os testes de diagnóstico antes da amostra desconhecida. Todos os
reagentes de diagnóstico relevantes devem ser submetidos à confirmação de
qualidade antes do uso. Deve-se ter cuidado especial com o meio usada em testes
de esterilidade e em estudos de monitoramento ambiental. Os meios usados para
o monitoramento ambiental de áreas
críticas devem ser preferencialmente embalados duas vezes e esterilizados
terminalmente. Se a esterilização terminal não for realizada, a meio deve ser
submetida a 100% de pré-incubação e inspeção antes do uso em uma área crítica.
[NOTA - O teste de promoção de crescimento para este meio deve ser realizado
após o estágio de pré-incubação.] Isso evitará que contaminações estranhas
sejam transportadas para ambientes controlados e evitará resultados
falso-positivos. Um nível elevado de ágar para placas de contato de superfície
deve ser verificado.
Dúvidas, só deixar seu comentário.
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