Reinforced Clostridial Medium

Indicação de uso

O meio Reinforced Clostridial Medium, também conhecido como Meio reforçado para Clostridium, é utilizado para o cultivo e enumeração de Clostrídios, outros anaeróbios e outras espécies de bactérias em amostras de alimentos, amostras clínicas e amostras de cosméticos e insumos farmacêuticos, quando aplicáveis. Atende a Farmacopeia Brasileira (FB), Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), Farmacopeia Europeia (EP) e Farmacopeia Japonesa (JP) para o ensaio de pesquisa de Clostridium em produtos não estéreis.

O meio Reinforced Clostridial Medium é um meio semi-sólido formulado por Hirsch e Grinstead. Este trabalho demonstrou que o meio superou outros meios de suporte no apoio ao crescimento de pequenos inóculos de Clostrídios e produziu maior número de células viáveis. Barnes e Ingram usaram o meio para diluir as células vegetativas de Clostridium perfringens. Barnes et al. usaram uma versão do meio sólido (ágar) para enumerar clostrídios em alimentos.

Reinforced Clostridial Medium é um meio enriquecimento não seletivo e permite o crescimento de várias bactérias anaeróbias e facultativas quando incubadas anaerobicamente. Este meio tem sido usado para detectar clostrídios, bifidobactérias e outros anaeróbios em alimentos e amostras fecais. Reinforced Clostridial Medium está listado na USP e FB como o meio recomendado para o isolamento de Clostridium sp em amostras de produtos farmacêuticos não estéreis

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Extrato de carne - 10,0 g
• Peptona - 10,0 g
• Extrato de levedura - 3,0 g
• Amido solúvel - 1,0 g
• Glicose monoidratada - 5,0 g
• Cloridrato de cisteína - 0,5 g
• Cloreto de sódio - 5,0 g
• Acetato de sódio - 3,0 g
• Ágar - 0,5 g 

O pH final é 6.8 ± 0.2

Reinforced Clostridial Medium contém extrato de carne bovina e peptona como fontes de carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais. O extrato de levedura fornece vitaminas do complexo B que estimulam o crescimento bacteriano. Glicose monoidratada fornece carboidratos. Cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. Em baixas concentrações, amido solúvel desintoxica subprodutos metabólicos. Cloridrato de cisteína é o agente redutor. O acetato de sódio atua como um tampão. A pequena quantidade de ágar torna o meio semi-sólido.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Os compendios trazem uma lista com os microrganismos a serem inoculados para o teste de grow promotion (também conhecido como teste de promoção de crescimento ou capacidade nutritiva dos meios de cultura). Outros micro-organismos, como cepas in house podem ser inoculados também de modo a comprovar a capacidade do meio de recuperar os mesmos. Inocular menos que 100 UFC do micro-organismo teste ao meio. Incubar à temperatura adequada e observar o crescimento visível comparando com um controle (branco) do mesmo meio de cultura.

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de micro-organismos.

Os micro-organismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Reinforced Clostridial Medium são:

Clostridium sporogenes ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) ou ATCC 19404 (NCTC 532 ou CIP 79.3)

A cepa teste de Clostridium cresce sob condições anaeróbicas neste meio em temperatura de 30° a 35°C por 24 a 48 horas. Como alternativa para preparar e depois diluir uma nova suspensão de células vegetativas de Cl. sporogenes, uma suspensão estável  de esporos é usada para inoculação em teste. A suspensão estável de esporos pode ser mantida entre 2° e 8°C por um período validado.

A ocorrência de crescimento anaeróbico de bastonetes (com ou sem endosporos) apresentando uma reação catalase negativa indica a presença de Clostrídios.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019