M-PA-C Agar

Indicação de uso

O meio M-PA-C Agar, é usado para o isolamento seletivo da Pseudomonas aeruginosa em amostras de água pela técnica de filtração em membrana. É o meio de escolha da Farmacopeia Brasileira 6ª edição e pelo Standard Methods For the Examination of Water and Wastewater, este último sendo o compêndio que a Farmacopeia Americana recomenda em seu capítulo 〈1231〉 WATER FOR PHARMACEUTICAL PURPOSES para análises microbiológicas em água.

Muitos dos meios utilizados para a recuperação da Pseudomonas aeruginosa pela técnica de membrana filtrante não tinha especificidade e era de valor limitado quando a microbiota heterogênea estava presente na amostra de água. Então Levin e Cabelli desenvolveram o M-PA Agar como um meio para filtração por membrana, seletivo para P. aeruginosa. Essa formulação incorporou antimicrobianos, canamicina, ácido nalidíxico, sulfapiridina e cicloheximida, que tornam o meio moderadamente seletivo. Novamente a formulação original foi modificada, elevando o pH e alterando a formulação e concentração de alguns componentes. O meio resultante foi designado M-PA-B Ágar. Brodsky e Ciebin modificaram esse meio, eliminando sulfapiridina e cicloheximida e produziram então o Agar M-PAC. Essa formulação resultou na capacidade de enumerar P. aeruginosa após apenas 24 horas de incubação a 41,5 °C em comparação às 72 horas necessárias com o ágar M-PA-B e 96 horas para um teste MPN presuntivo. O ágar M-PA-C é identificado como Modificado Agar M-PA Standard Methods For the Examination of Water and Wastewater

Pseudomonas podem ser encontradas na água (doce, salobra ou do mar), no solo, na poeira em suspensão, no ar e nos vegetais. Várias espécies de Pseudomonas têm sido isoladas em água mineral, incluindo P. mandelii, P. migulae, P. rhodesiae e P. veronii, mas a principal preocupação é a presença de P. aeruginosa, por ser a mais comum como patógeno oportunista para humanos.

Para a contagem de P. aeruginosa, utiliza-se a técnica de membrana filtrante (UFC/100mL). O método da filtração por membrana tem as vantagens de ser mais simples de executar, não exigindo a confirmação e permitindo uma contagem direta de P. aeruginosa. O procedimento de filtração em membrana é limitado à análise de amostras líquidas límpidas, sem sólidos em suspensão, que possam ser filtradas através de uma membrana de poro 0,45μm. Sua principal vantagem é que permite a inoculação de maiores volumes da amostra, concentrando na membrana os micro-organismos presentes na quantidade inoculada. O limite de detecção é de 1 UFC por volume inoculado, sendo indicado para amostras com contagens abaixo do limite de detecção de outros procedimentos. Porém, a área de exposição para o desenvolvimento bacteriano é pequena, sendo necessária, em muitos casos, a diluição do material para que as Unidades Formadoras de Colônia (UFC) consigam ser quantificadas nos casos em que houver uma contaminação elevada. A quantificação é feita pelo método de contagem em placas, utilizando o m-Pac como meio de cultivo.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• L-lisina - 5,0 g
• Cloreto de sódio - 5,0 g
• Extrato de levedura - 2,0 g
• Xilose - 1,25 g
• Sacarose - 1,25 g
• Lactose - 1,25 g
• Vermelho de fenol - 0,08 g
• Citrato de amônio e ferro III - 0,8 g
• Sulfato de magnésio - 1,5 g
• Ágar - 12,0 g
• Tiossulfato de sódio - 5,0 g
• Canamicina - 8,0 mg
• Ácido nalidíxico - 37,0 mg

O pH final é 7.1 ± 0.2

O extrato de leveduras, a lisina e os carboidratos proveem os micro-organismos de nitrogênio, fonte de energia e vitaminas para o seu metabolismo. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico, os sais proveem de íons, o vermelho fenol é utilizado como indicador que muda para amarelo com a produção de ácido resultante da fermentação dos carboidratos, a canamicina inibe a síntese da proteína em micro-organismos gram positivos, e o ácido nalidíxico bloqueia o crescimento de gram negativos. Agar é o agente solidificante.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Não autoclavar. Ferver o meio por um minuto. Use o meio dentro de 1 semana após a preparação

Devido à presença de substratos sensíveis, recomenda-se manter o produto protegido de incidência direta de luz (natural ou artificial) e evitar grandes variações de temperatura até a utilização.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

As farmacopeias não citam o ATCC de P. aeruginosa para esse meio em especifico. Neste caso pode-se usar o que o certificado do fabricante sugere: Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 e ATCC 27853 para controle positivo e  Escherichia coli ATCC 25922 para controle negativo

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa Pseudomonas em água.

As colônias de 0,8-2,2 mm, de aparência plana, com bordas externas claras e centros marrom-esverdeados a preto-esverdeados são indicativas de Pseudomonas aeruginosa.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 42ª ed. 2019

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019

Hardy Diagnostics – Site acessado em 20/02/2020

Certificado Laborclin - LB 172177 - Rev 02 – 05/2018