Vamos falar sobre Farmacopeia?

 Hoje resolvi falar um pouco sobre Farmacopeia

Participo de vários grupos no Whatsapp sobre Microbiologia e Controle de qualidade. E tenho percebido uma certa dificuldade e até uma certa comodidade principalmente de analistas em inicio de carreira em encontrar algumas informações. Vira e mexe eu cito algum capitulo da farmacopeia. De forma a instigar a pessoa a ler.

Entendam esse texto como uma crítica construtiva. Quando eu atuava, não existia essa facilidade em trocar mensagens (nem existia Whatsapp) e era difícil achar informações em buscadores, Eu aprendi a usar farmacopeia com a Britânica, na mesa do meu diretor na época. Um cliente queria saber parâmetros e meu diretor disse: procura aí e gaste o tempo que for preciso. Era a primeira vez que eu manuseava uma farmacopeia. Desde então virou minha “Bíblia”. E eu tinha acesso à Farmacopeia Britânica, Europeia, Brasileira, Portuguesa e a Americana (USP). Como eu prestava serviços, padronizávamos os métodos segundo a USP. Não só para produtos farmacêuticos, mas também para cosméticos, descartáveis, veterinários, água etc.

A Farmacopeia não precisa ficar restrita à área farmacêutica, pode ser usada em outras áreas também, como indústria cosmética, descartáveis, veterinária etc. Você tem duvida sobre, monitoramento, validação, ensaios, sanitização, processos? Pois a farmacopeia tem algo a lhe dizer. Não tem acesso à farmacopeia americana? A Brasileira está disponível gratuitamente no site da Anvisa pelo link https://www.gov.br/anvisa/pt-br/assuntos/farmacopeia/farmacopeia-brasileira.

Basicamente as farmacopeias dividem-se em monografias, que traz todas as informações importantes sobre os insumos e os capítulos gerais que descrevem os métodos e dão informações gerais como processos.

A Farmacopeia Americana não tem mais versão física. A Brasileira está em pdf.

Vamos á alguns conceitos:

1. O que é a Farmacopeia Brasileira?

A Farmacopeia Brasileira é o Código Oficial Farmacêutico do País, onde se estabelecem, dentre outras coisas, os requisitos mínimos de qualidade para fármacos, insumos, drogas vegetais, medicamentos e produtos para a saúde. Tem por finalidade promover a saúde da população, estabelecendo requisitos de qualidade e segurança dos insumos para a saúde, especialmente dos medicamentos, apoiando as ações de regulação sanitária e induzindo ao desenvolvimento científico e tecnológico nacional.

2. Como é elaborada a Farmacopeia Brasileira?

A Farmacopeia Brasileira é uma entidade particular?

Qual a relação entre a Farmacopeia Brasileira e a Anvisa?

É elaborada por meio de projetos de pesquisa, em parceria com universidades credenciadas. Posteriormente, a Comissão da Farmacopeia Brasileira (CFB), nomeada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), homologa os trabalhos desenvolvidos. A publicação se dá por meio de RDC, que oficializa a Farmacopeia para uso no território brasileiro. A publicação, a revisão e a atualização são, por força de obrigações regimentais, função da Anvisa.

3. Qual a finalidade da Farmacopeia?

Promover a saúde da população, por meio do estabelecimento de requisitos de qualidade e segurança para fármacos, drogas vegetais, insumos, medicamentos e produtos para saúde, e assim apoiar as ações de vigilância sanitária e induzir o desenvolvimento científico e tecnológico nacional.

4. Quais são as atividades da Farmacopeia Brasileira?

Além da elaboração e atualização de métodos e monografias do compêndio oficial, a farmacopeia se dedica também à produção e certificação de substâncias químicas de referência (SQR) e padrões, elaboração de formulários nacionais, apoio e incentivo à formação e aperfeiçoamento de recursos humanos na área de controle de qualidade, apoio à pesquisa científica e tecnológica, aprovação e publicação das Denominações Comuns Brasileiras (DCB), dentre outras.

5. O que são os Comitês Técnicos Temáticos (CTT)?

São grupos de profissionais renomados e com experiência em áreas específicas do conhecimento, que desenvolvem trabalhos de interesse sanitário para serem incluídos na Farmacopeia Brasileira e para apoiar as ações sanitárias da Anvisa. Conheça os Comitês Técnicos Temáticos das Farmacopeia Brasileira:

CTT de Apoio à Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos - APP

CTT de Produtos Biológicos - BIO

CTT Correlatos de Medicamentos - COR

CTT Denominações Comuns Brasileiras - DCB

CTT de Equivalência Farmacêutica e Bioequivalência de Medicamentos - EQB

CTT de Especialidades Farmacêuticas - ESP

CTT de Excipientes e Adjuvantes - EXA

CTT Farmacognosia - FCG

CTT de Gases Medicinais - GAS

CTT de Produtos Hemoderivados - HEM

CTT de Homeopatia - HOM

CTT de Ingredientes Farmacêuticos Ativos - IFA

CTT de Medicamentos Magistrais e Oficinais - MAG

CTT de Microbiologia - MCB

CTT de Radiofármacos - RAD

CTT de Substâncias Químicas de Referência - SQR

6. Desde quando o Brasil possui uma Farmacopeia? (Histórico)

O primeiro código do Brasil colônia foi a Farmacopeia Geral para o Reino e os Domínios de Portugal, sancionada em 1794 e obrigatória em nosso país a partir de 1809. Após a independência foram utilizados, além desta, o Codex Medicamentarius Gallicus francês e o Código Farmacêutico Lusitano, hoje considerado como a 2ª edição da Farmacopeia Portuguesa.

Mais tarde, o Decreto n° 8.387 de 19/01/1882 estabeleceu que “para o preparo dos medicamentos oficiais seguir-se-á a Farmacopeia Francesa, até que seja composta uma farmacopeia brasileira.....”

Em 1926, as autoridades sanitárias do País aprovaram a proposta de um Código Farmacêutico Brasileiro, apresentada pelo Farmacêutico e Professor de Farmácia Rodolpho Albino Dias da Silva. Aprovado pelas autoridades sanitárias da época, esse Código foi oficializado em 1929 e tornou-se a primeira edição da Farmacopeia Brasileira. Obra de um único autor, a primeira edição da Farmacopeia Brasileira equiparava-se às Farmacopeias dos países tecnologicamente desenvolvidos, porém diferenciava-se das demais por conter descrições de mais de 200 plantas medicinais, a maioria delas de origem brasileira.

A segunda edição da Farmacopeia Brasileira foi publicada em 1959 (Decreto Federal nº 45.502 de 27/02/1959) e a terceira edição saiu em 1976 (Decreto nº 78840 de 25/06/1976). Publicada em 1988 (Decreto 96.607 de 30/08/1988), a quarta edição foi atualizada por vários fascículos até 2005.

Até 2010 as quatro edições da Farmacopeia Brasileira continuavam em vigor. A Quinta Edição, lançada em dezembro de 2010, revogou todas as edições anteriores e busca fazer a atualização e revisão de todos os métodos e monografias publicados até então.

7. Onde se localiza a sede administrativa da Farmacopeia Brasileira?

A Coordenação da Farmacopeia Brasileira – COFAR está localizada na Anvisa, em Brasília. O endereço para contato é: SIA Trecho 5, Área Especial 57, Bloco E, 1º andar, sala 4 – CEP: 71205-050 – Brasília – DF. O contato pode também ser feito por e-mail: farmacopeia@anvisa.gov.br.

8. A Farmacopeia Brasileira possui laboratório próprio?

A Farmacopeia Brasileira, até o momento, não possui laboratório próprio. Seus trabalhos de pesquisa, elaboração de monografias, ensaios laboratoriais, validação e certificação de produtos são realizados por universidades credenciadas e por órgãos oficiais de controle de qualidade de medicamentos.

9. Todo o país é obrigado a ter a sua própria farmacopeia ou pode adotar a farmacopeia de outro país?

Não há obrigatoriedade de possuir uma Farmacopeia, Qualquer país pode elaborar sua própria farmacopeia ou adotar a de outros países como oficial. Entretanto, como a Farmacopeia reflete o avanço da ciência e da tecnologia de um país, a existência de uma farmacopeia nacional pode ser considerada como um assunto de segurança nacional, por assegurar a qualidade de insumos para fins farmacêuticos importados ou medicamentos em uso no país.

Na ausência de monografia oficial de matéria-prima, formas farmacêuticas, correlatos e métodos gerais inscritos na Farmacopeia Brasileira, poderá ser adotada monografia oficial, última edição, de um dos seguintes compêndios internacionais:

Farmacopeia Alemã

Farmacopeia Americana

Farmacopeia Argentina

Farmacopeia Britânica

Farmacopeia Europeia

Farmacopeia Francesa

Farmacopeia Internacional (OMS)

Farmacopeia Japonesa

Farmacopeia Mexicana

Farmacopeia Portuguesa

Veja, na íntegra, a Resolução (RDC 37/2009) que dispõe sobre as Farmacopeias reconhecidas pela Anvisa.

10. A Farmacopeia Brasileira segue os padrões das farmacopeias internacionais ou tem normativa própria?

A Farmacopeia se insere, rigidamente, nos padrões internacionais, porém, procura soluções coerentes com o desenvolvimento tecnológico de nosso país, como, por exemplo, o estabelecimento de métodos alternativos de análises.

11. As farmácias são obrigadas a ter a Farmacopeia Brasileira? Por quê?

O Decreto nº 96.607, de 30 de agosto de 1988, determina que as drogarias e farmácias são obrigadas a manter exemplar atualizado da Farmacopeia Brasileira. Há diversas razões para isso, mas o principal é a segurança do consumidor, nos casos em que se necessite de informações quanto à identificação e característica de um medicamento.

Conforme o artigo 4º do mesmo Decreto, além das drogarias e farmácias são obrigados a manter exemplar atualizado da Farmacopeia Brasileira, os estabelecimentos de ensino de Medicina, Farmácia, Odontologia e Veterinária, os órgãos de fiscalização e controle de qualidade de medicamentos, os laboratórios industriais e os estabelecimentos congêneres.

Os estabelecimentos farmacêuticos, médicos, de odontologia e veterinários, incluindo o setor de ensino, devem dispor de exemplares para consulta, sem obrigatoriedade.

Entretanto, com o lançamento virtual da FB5, as informações poderão ser acessadas a todo o momento, desde que tenha internet.

12. Como faço para obter a quinta edição da Farmacopeia Brasileira?

A quinta edição está disponível na página da Anvisa, com acesso gratuito. A obra impressa será comercializada pela Editora da Fiocruz.

13. Utilizo monografia constante em edição anterior da Farmacopeia Brasileira, mas que não foi publicada na FB 5. Posso continuar utilizando as edições anteriores?

As edições anteriores da FB foram revogadas pela RDC 49/2010. Caso não encontre uma determinada monografia específica na FB 5, utilizar os outros compêndios reconhecidos pela Anvisa, relacionados na RDC 37/2009.

Não tenha medo de consultar uma Farmacopeia. Crie o hábito de ler. Um bizu: se você tiver uma farmacopeia em pdf pressione ctrl f e digite um termo que esteja relacionado ao assunto que você procura; fica bem mais fácil de encontrar.

É claro que as farmacopeias não contemplam todas as áreas. Mas a Anvisa possui uma área chamada de Bibliotecas temáticas: https://www.gov.br/anvisa/pt-br/assuntos/regulamentacao/legislacao/bibliotecas-tematicas, que contem uma compilação das legislações de várias áreas. Você não precisa entender de tudo, mas conhecer sua área de atuação é importante.

Boa leitura!

Bibliografia:

https://www.gov.br/anvisa/pt-br/acessoainformacao/perguntasfrequentes/farmacopeia/farmacopeia-1 consultado em 09/12/2020

 

 

m Endo Agar LES

Indicação de uso

O m Endo Agar Les, também conhecido como Endo ágar, Endo ágar LES (Lawrence Experimental Station formulation) é um meio seletivo utilizado para pesquisa de coliformes na água por filtração em membrana, citado na USP no capitulo 〈1231〉 WATER FOR PHARMACEUTICAL PURPOSES que por sua vez sugere o Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater como métodos microbiológicos de análise em água e também citado como opção de meio em pesquisa de coliformes em água na Farmacopeia Brasileira.

McCarthy, Delaney e Grasso formularam Endo Agar LES (Estação Experimental de Lawrence) para teste de coliformes em água bactérias por um procedimento de filtração em membrana de duas etapas usando Lauryl Tryptose Broth como enriquecimento preliminar. Ele recuperou um maior número de coliformes por este método em comparação com a técnica de uma etapa usando m Endo Broth. A American Public Health Association especifica o uso de m Endo Agar LES na filtração por membrana de coliformes totais como padrão procedimento para testar água potável e água engarrafada. É também especificado para uso na fase concluída da norma técnica de fermentação total de coliformes

Logo após a publicação de Holt-Harris e Teague em um artigo que descreve um novo meio de cultura para a diferenciação de micro-organismos entéricos através do uso de eosina e corantes de azul de metileno, Levine descreveu uma modificação de sua formulação, que ele afirma ter dado melhor diferenciação entre o que agora é conhecido como Escherichia e Enterobacter espécie. As duas formulações diferem em que Levine EMB Agar não contém sacarose. Ambas as formulações foram desenvolvidas para melhorar as propriedades diferenciadoras de Endo Agar, que foi desenvolvido anteriormente.

Formulação e Preparo

• Extrato de levedura - 1,2 g
• Casitone - 3,7 g
• Tiopeptona - 3,7 g
• Tryptose - 7,5 g
• Lactose - 9,4 g
• Fosfato dipotássico - 3,3 g
• Fosfato Monopotássico - 1,0 g
• Cloreto de Sódio - 3,7 g
• Desoxicolato de sódio - 0,1 g
• Lauril Sulfato de Sódio - 0,05 g
• Sulfito de sódio - 1,6 g
• Fucsina básica - 0,8 g
• Agar - 15,0 g

Reidrate o produto em 1 L de água contendo 20 mL de etanol a 95%. Aquecer com agitação frequente e ferver durante 1 minuto para dissolver completamente o pó. NÃO AUTOCLAVE

O pH 7,2 ± 0,2

CUIDADO: A fucsina básica é considerada cancerígena e mutagênica. Evite o contato com a pele, ingestão ou exposição a mucosas e membranas. Siga as instruções do fabricante e da SDS.

m Endo Agar LES contém peptonas como fontes de carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais. O extrato de levedura fornece vitaminas do complexo B, que estimulam o crescimento bacteriano. A lactose é o carboidrato. Os fosfatos são agentes tampão. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico do meio. Desoxicolato de sódio e lauril sulfato de sódio são adicionados como inibidores.

A fucsina básica é um indicador de pH. O sulfito de sódio é adicionado para descolorir a solução básica de fucsina. O ágar é o agente de solidificação.

Bactérias fermentadoras de lactose produzem acetaldeído que reage com o sulfito de sódio e fucsina para formar colônias vermelhas. O desenvolvimento de um brilho metálico ocorre quando o organismo produz aldeídos com a rápida fermentação da lactose. Se o inóculo for muito pesado, o brilho será suprimido. As bactérias não fermentadoras de lactose formam colônias claras e incolores.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

As farmacopeias não apresentam as cepas para Grow Promotion, nesse caso pode-se utilizar os micro-organismos indicados no certificado do fabricante:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Escherichia coli ATCC 25922

Salmonella enterica subsp. Enterica sorotipo Typhimurium ATCC 14028

Verificar a inibição

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Resultados esperados

Todas as colônias que são vermelhas e têm o brilho metálico característico são consideradas coliformes. O brilho pode cobrir toda a colônia, pode estar apenas no centro ou pode aparecer apenas nas bordas.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada. Nem todos os listados acima precisam ser usados. Isso vai depender do método.

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa do micro-organismo de interesse. No caso do S. aureus, conforme recomendação do fabricante, inocular 10³.

Realizar GP em cada novo lote de meio de cultura adquirido pronto para uso ou preparado no laboratório, em paralelo com um meio de cultura previamente aprovado.

Os micro-organismos devem ser rastreáveis de uma Cultura de Coleção de Referência e devem estar em não mais do que 5 passagens da Cultura de Referência. Compare o crescimento no novo meio de cultura com o crescimento no meio previamente aprovado. O crescimento deve ser "comparável“. Não existe na USP a definição de quantidade do que é “comparável” Em paralelo realizar o controle do inóculo em ágar não seletivo: deve haver ≤ 100 UFC. E se não houver lote previamente aprovado? Considere adicionar outros Analistas do Laboratório. Use um número significativo de replicatas. A média das médias pode ser considerada como ponto de referência. Essas recomendações servem para a promoção de crescimento de qualquer meio.

Limitações do procedimento

Ocasionalmente, organismos não coliformes podem produzir colônias brilhantes típicas. Organismos coliformes também podem ocasionalmente produzir colônias atípicas (colônias vermelhas escuras ou nucleadas sem brilho). É aconselhável verificar os dois tipos de colônia

Fontes:

United States Pharmacopeia 43ª ed. 2020

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019

EMB Agar

 

Indicação de uso

O EMB Agar, também conhecido como Eosina Azul de Metileno, Eosin Methylene Blue Agar, Levine EMB Agar ou Levine Eosin–Methylene Blue–Agar Medium (LEMB-Agar) é um meio seletivo utilizado para pesquisa de E. coli em amostras de Suplementos Nutricionais E Dietéticos descrito no capitulo 〈2022〉 MICROBIOLOGICAL PROCEDURES FOR ABSENCE OF SPECIFIED MICROORGANISMS—NUTRITIONAL AND DIETARY SUPPLEMENTS, USP e também citado como opção de meio em pesquisa de coliformes fecais em água na Farmacopeia Brasileira e no Standard Methods for Examination of Water & Wastewater. O EMB é um meio para diferenciação ligeiramente seletivo também utilizado para o isolamento e diferenciação de bacilos entéricos gram-negativos (enterobactérias e outros bastonetes gram-negativos) provenientes de amostras clínicas. É recomendado pelo APHA para análise de alimentos e lácteos. O EMB ágar (com ou sem sacarose) é incluído no conjunto de meios de isolamento de seletividade reduzida para a Salmonella de amostras fecais e de outro tipo. As bactérias gram-positivas como, por exemplo, estafilococos, leveduras e estreptococos fecais, poderão desenvolver-se neste meio e formar colônias punctiformes ou poderão ficar inibidas.

Logo após a publicação de Holt-Harris e Teague de um artigo que descreve um novo meio de cultura para a diferenciação de micro-organismos entéricos através do uso de eosina e corantes de azul de metileno, Levine descreveu uma modificação de sua formulação, que ele afirma ter dado melhor diferenciação entre o que agora é conhecido como Escherichia e Enterobacter espécie. As duas formulações diferem em que Levine EMB Agar não contém sacarose. Ambas as formulações foram desenvolvidas para melhorar as propriedades diferenciadoras de Endo Agar, que foi desenvolvido anteriormente.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro (Ajustada e/ou suplementada conforme necessário para cumprir os critérios do desempenho)

• Hidrolisado pancreático de gelatina - 10,0 g
• Lactose - 10 g
• Fosfato dipotássio - 2,0 g
• Agar- 15 g
• Eosina Y - 400 mg
• Azul-de-metileno - 65 mg

O pH 7,1 ± 0,2

O hidrolisado e a lactose servem como fonte de energia. Fosfato dipotássio é um agente tamponante. Agar é um agente solidificante.  Os corantes de eosina Y e azul de metileno em Levine EMB Agar tornam o meio ligeiramente seletivo na medida em que inibem gram- bactérias positivas em um grau limitado. Essas tinturas também desempenham um papel na diferenciação entre fermentadores de lactose e lactose não fermentadores devido à presença ou ausência de absorção de corante em as colônias bacterianas. Coliformes, como organismos fermentadores de lactose, são visualizados como colônias preto-azuladas, enquanto as colônias de Salmonella e Shigella, como não fermentadores de lactose, aparecem incolor, transparente ou âmbar. E. coli apresenta um brilho metálico esverdeado na luz refletida, preto azulado centro na luz transmitida.

Algumas bactérias gram-positivas, como estreptococos fecais, estafilococos e leveduras, irão crescer neste meio e geralmente formam colônias pontuais. Uma série de micro-organismos não patogênicos, bactérias gram-negativas não fermentadoras de lactose crescerão neste meio e deve ser distinguida das cepas patogênicas por meio de testes bioquímicos adicionais.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Esterilizar em autoclave usando um ciclo validado.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

As farmacopeias não apresentam as cepas para Grow Promotion, nesse caso pode-se utilizar os micro-organismos indicados no certificado do fabricante:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 33495

Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhi ATCC 19430

Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhimurium ATCC 14028

Shigella dysenteriae ATCC 9361

Shigella flexneri ATCC 12022

Resultados esperados

Escherichia coli - Grande, preto-azulado, brilho verde metálico

Enterobacter / Klebsiella - Grande, mucóide, preto-azulado

Proteus - Grande, incolor

Salmonela - Grande, incolor

Shigella - Grande, incolor

Bactéria Gram-positiva - Sem crescimento, para crescimento leve

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada. Nem todos os listados acima precisam ser usados. Isso vai depender do método.

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa do micro-organismo de interesse.

Realizar GP em cada novo lote de meio de cultura adquirido pronto para uso ou preparado no laboratório, em paralelo com um meio de cultura previamente aprovado.

Os micro-organismos devem ser rastreáveis de uma Cultura de Coleção de Referência e devem estar em não mais do que 5 passagens da Cultura de Referência. Compare o crescimento no novo meio de cultura com o crescimento no meio previamente aprovado. O crescimento deve ser "comparável“. Não existe na USP a definição de quantidade do que é “comparável” Em paralelo realizar o controle do inóculo em ágar não seletivo: deve haver ≤ 100 UFC. E se não houver lote previamente aprovado? Considere adicionar outros Analistas do Laboratório. Use um número significativo de replicatas. A média das médias pode ser considerada como ponto de referência. Essas recomendações servem para a promoção de crescimento de qualquer meio.

Fontes:

United States Pharmacopeia 43ª ed. 2020

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019

 

ÁGAR BURKHOLDERIA CEPACIA SELETIVO - BCSA

Indicação de uso

O Ágar Burkholderia cepacia Seletivo – BCSA é um meio seletivo utilizado para o crescimento qualitativo do complexo Burkholderia cepacia em amostras diversas. As espécies do complexo BCC são isoladas frequentes no ambiente, água, solo, plantas e nos seres humanos podem colonizar o trato respiratório.

O F.D.A. alertou sobre a necessidade de se testar a presença deste micro-organismo no ambiente, na água e nas matérias primas e produtos acabados devido a uma série de recalls envolvendo complexo Burkholderia cepacia.

A Farmacopeia Americana (USP) publicou no segundo suplemento da USP 42 NF 37 de 2019, por enquanto somente ela solicita o teste. Mas acredito que em breve outras farmacopeias irão solicitar esse teste. No capitulo de requisitos gerais para testes microbiológicos em produtos não estéreis, a descrição do meio BCSA para pesquisa do complexo B. cepacia (BCC). É o capítulo <60> MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS — TESTS FOR BURKHOLDERIA CEPACIA COMPLEX. Especialmente as categorias de produtos a serem testados são aquelas para uso por inalação ou preparações aquosas de uso oral, mucosa oral, cutânea ou nasal.

O crescimento de espécie B. cepacia, que pode vir a passar despercebido em meios convencionais como ágar sangue e MacConkey, devido ao crescimento lento de B. cepacia frente a outras bactérias como K. pneumoniae mucoides, P. aeruginosa e espécie Staphylococcus, o que pode acarretar em um resultado falso negativo.

Esta é uma bactéria que ao longo do tempo vem ganhando uma crescente atenção, a principio sendo encontrada em sistemas de agua e assim como a Pseudomonas, PODE criar biofilme.

Burkholderia cepacia previamente era denominada Pseudomonas cepacia. Em 1992 Bcc foi transferida do gênero Pseudomonas para o gênero Burkholderia. O gênero Burkholderia contém mais de 60 espécies. Mais tarde com a realização de 16 rRNA resultou a divisão de B. cepacia em espécies intimamente relacionadas, denominadas complexo B. cepacia. Bcc consiste em espécies intimamente relacionadas com ßprotobactéria

É uma bactéria Gram Negativa. Possui 20 diferentes espécies, mas fenotipicamente similares. As espécies do complexo Bcc são isoladas frequentemente no ambiente, água, solo, plantas e nos seres humanos, podem colonizar o trato respiratório. Patógeno oportunista causando infecções respiratórias crônicas em pacientes imunossuprimidos como pacientes com fibrose cística e hemoglobinopatias das células falciformes. São frequentemente resistentes aos antibióticos conhecidos

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Peptona Caseína - 10,0g
• Lactose - 10,0g
• Sacarose - 10,0g
• Cloreto de Sódio - 5,0g
• Extrato de Levedura - 1,5g
• Vermelho de Fenol - 0,08g
• Gentamicina - 10,0g
• Vancomicina - 2,5g
• Cristal Violeta - 2,0g
• Polimixina - B 6,000U
• Ágar - 14,0g

 O pH final é 6.8 ± 0.3

Os agentes seletivos cristal violeta, a polimixina B, gentamicina e a vancomicina, inibem organismos comumente encontrados nas secreções respiratórias que não sejam o Bcc. Sacarose e lactose são carboidratos para enriquecimento e diferenciação com vermelho de fenol como indicador de pH.

OBS.: Embora esse meio já exista, atualmente somente a Plastlabor fornece a formulação de acordo com o capitulo 60 da USP. Isso é importante ser verificado para qualquer meio farmacopeico, A Plastlabor já fornece em placas prontas. Acredito que posteriormente outros fabricantes vão se adequar.

O meio deverá ser armazenado em ambiente com temperatura controlada entre 2 - 15°C ao abrigo da luz.

Cabe ressaltar que, a faixa de temperatura escolhida para o seu armazenamento deverá ser seguida até o término do seu prazo de validade, a fim de evitar a formação de água de condensação no produto.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

Os micro-organismos citados pela United States Pharmacopeia para o teste de Grow Promotion em BCSA são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

B. cepacia ATCC 25416, B. cenocepacia ATCC BAA 245 e B. multivorans ATCC BAA 247

Para verificar capacidade inibitória:

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, ou NBRC 13275 e Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, ou NBRC 13276

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa B. cepacia.

Realizar GP em cada novo lote de meio de cultura adquirido pronto para uso ou preparado no laboratório, em paralelo com um meio de cultura previamente aprovado.

Os micro-organismos devem ser rastreáveis de uma Cultura de Coleção de Referência e devem estar em não mais do que 5 passagens da Cultura de Referência. Compare o crescimento no novo meio de cultura com o crescimento no meio previamente aprovado. O crescimento deve ser "comparável“. Não existe na USP a definição de quantidade do que é “comparável” Em paralelo realizar o controle do inóculo em ágar não seletivo: deve haver ≤ 100 UFC. E se não houver lote previamente aprovado? Considere adicionar outros Analistas do Laboratório. Use um número significativo de replicatas. A média das médias pode ser considerada como ponto de referência. Essas recomendações servem para a promoção de crescimento de qualquer meio.

A possível presença de Bcc é indicada pelo crescimento de colônias marrom-esverdeadas com halos amarelos, ou colônias brancas cercadas por uma zona vermelho-rosa no BCSA. Qualquer crescimento no BCSA é confirmado por testes de identificação.

Fontes:

United States Pharmacopeia 42ª ed. 2019

Certificado Plastlabor

Apresentação: Complexo Burkholderia cepacia (Bcc) - USP <60> - Apresentado pela Plastlabor

M-PA-C Agar

Indicação de uso

O meio M-PA-C Agar, é usado para o isolamento seletivo da Pseudomonas aeruginosa em amostras de água pela técnica de filtração em membrana. É o meio de escolha da Farmacopeia Brasileira 6ª edição e pelo Standard Methods For the Examination of Water and Wastewater, este último sendo o compêndio que a Farmacopeia Americana recomenda em seu capítulo 〈1231〉 WATER FOR PHARMACEUTICAL PURPOSES para análises microbiológicas em água.

Muitos dos meios utilizados para a recuperação da Pseudomonas aeruginosa pela técnica de membrana filtrante não tinha especificidade e era de valor limitado quando a microbiota heterogênea estava presente na amostra de água. Então Levin e Cabelli desenvolveram o M-PA Agar como um meio para filtração por membrana, seletivo para P. aeruginosa. Essa formulação incorporou antimicrobianos, canamicina, ácido nalidíxico, sulfapiridina e cicloheximida, que tornam o meio moderadamente seletivo. Novamente a formulação original foi modificada, elevando o pH e alterando a formulação e concentração de alguns componentes. O meio resultante foi designado M-PA-B Ágar. Brodsky e Ciebin modificaram esse meio, eliminando sulfapiridina e cicloheximida e produziram então o Agar M-PAC. Essa formulação resultou na capacidade de enumerar P. aeruginosa após apenas 24 horas de incubação a 41,5 °C em comparação às 72 horas necessárias com o ágar M-PA-B e 96 horas para um teste MPN presuntivo. O ágar M-PA-C é identificado como Modificado Agar M-PA Standard Methods For the Examination of Water and Wastewater

Pseudomonas podem ser encontradas na água (doce, salobra ou do mar), no solo, na poeira em suspensão, no ar e nos vegetais. Várias espécies de Pseudomonas têm sido isoladas em água mineral, incluindo P. mandelii, P. migulae, P. rhodesiae e P. veronii, mas a principal preocupação é a presença de P. aeruginosa, por ser a mais comum como patógeno oportunista para humanos.

Para a contagem de P. aeruginosa, utiliza-se a técnica de membrana filtrante (UFC/100mL). O método da filtração por membrana tem as vantagens de ser mais simples de executar, não exigindo a confirmação e permitindo uma contagem direta de P. aeruginosa. O procedimento de filtração em membrana é limitado à análise de amostras líquidas límpidas, sem sólidos em suspensão, que possam ser filtradas através de uma membrana de poro 0,45μm. Sua principal vantagem é que permite a inoculação de maiores volumes da amostra, concentrando na membrana os micro-organismos presentes na quantidade inoculada. O limite de detecção é de 1 UFC por volume inoculado, sendo indicado para amostras com contagens abaixo do limite de detecção de outros procedimentos. Porém, a área de exposição para o desenvolvimento bacteriano é pequena, sendo necessária, em muitos casos, a diluição do material para que as Unidades Formadoras de Colônia (UFC) consigam ser quantificadas nos casos em que houver uma contaminação elevada. A quantificação é feita pelo método de contagem em placas, utilizando o m-Pac como meio de cultivo.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• L-lisina - 5,0 g
• Cloreto de sódio - 5,0 g
• Extrato de levedura - 2,0 g
• Xilose - 1,25 g
• Sacarose - 1,25 g
• Lactose - 1,25 g
• Vermelho de fenol - 0,08 g
• Citrato de amônio e ferro III - 0,8 g
• Sulfato de magnésio - 1,5 g
• Ágar - 12,0 g
• Tiossulfato de sódio - 5,0 g
• Canamicina - 8,0 mg
• Ácido nalidíxico - 37,0 mg

O pH final é 7.1 ± 0.2

O extrato de leveduras, a lisina e os carboidratos proveem os micro-organismos de nitrogênio, fonte de energia e vitaminas para o seu metabolismo. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico, os sais proveem de íons, o vermelho fenol é utilizado como indicador que muda para amarelo com a produção de ácido resultante da fermentação dos carboidratos, a canamicina inibe a síntese da proteína em micro-organismos gram positivos, e o ácido nalidíxico bloqueia o crescimento de gram negativos. Agar é o agente solidificante.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Não autoclavar. Ferver o meio por um minuto. Use o meio dentro de 1 semana após a preparação

Devido à presença de substratos sensíveis, recomenda-se manter o produto protegido de incidência direta de luz (natural ou artificial) e evitar grandes variações de temperatura até a utilização.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

As farmacopeias não citam o ATCC de P. aeruginosa para esse meio em especifico. Neste caso pode-se usar o que o certificado do fabricante sugere: Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 e ATCC 27853 para controle positivo e  Escherichia coli ATCC 25922 para controle negativo

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa Pseudomonas em água.

As colônias de 0,8-2,2 mm, de aparência plana, com bordas externas claras e centros marrom-esverdeados a preto-esverdeados são indicativas de Pseudomonas aeruginosa.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 42ª ed. 2019

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019

Hardy Diagnostics – Site acessado em 20/02/2020

Certificado Laborclin - LB 172177 - Rev 02 – 05/2018