Mannitol Salt Agar

Indicação de uso

O meio Mannitol Salt Agar, também conhecido como Agar Sal Manitol, é utilizado para o isolamento seletivo de Staphylococcus e para a detecção de Staphylococcus aureus provenientes de amostras clínicas. Mannitol Salt Agar é listado como um dos vários meios recomendados para a enumeração de bactérias gram-positivas em cosméticos, amostras clínicas, e produtos farmacêuticos. Também usado na indústria alimentícia para o isolamento e identificação de Staphylococcus em líquidos e produtos lácteos, carnes e derivados, incluindo conservas e pescados. É usado no controle de qualidade microbiológico de produtos farmacêuticos não estéreis para Staphylococcus aureus atendendo a Farmacopeia Brasileira (FB), Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), Farmacopeia Europeia (EP) e Farmacopeia Japonesa (JP).

Koch, em 1942, relatou que apenas os Staphylococcus crescem em meio ágar contendo 7,5% de cloreto de sódio. Chapman estudou este fenômeno em maior detalhe e concluiu que a adição de 7,5% de cloreto de sódio ao Manitol Vermelho de Fenol Ágar resulta em um meio melhorado para o isolamento de Staphylococcus de coagulação plasmática.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• Hidrolisado de pancreático de caseína - 5,0 g
• Peptona péptica de tecido animal - 5,0 g
• Extrato de carne - 1,0 g
• D-manitol - 10,0 g
• Cloreto de sódio - 75,0 g
• Ágar - 15,0 g
• Vermelho fenol - 25,0 mg

O pH final é 7.4 ± 0.2

O Mannitol Salt Agar contém hidrolisado de pancreático de caseína e peptonas que fornecem nutrientes essenciais para o crescimento como o nitrogênio, carbono e enxofre. O cloreto de sódio a uma concentração de 7,5% resulta numa inibição parcial ou completa de outros organismos bacterianos que não são Staphylococcus. A fermentação do manitol, conforme indicada por uma alteração no indicador vermelho de fenol, ajuda na diferenciação das espécies de Staphylococcus devido à produção de ácido. Os Staphylococcus com resultados positivos para a coagulase (por exemplo, Staphylococcus aureus) produzem colônias amarelas e um meio amarelo circundante ao passo que os Staphylococcus com resultados negativos para a coagulase produzem colônias vermelhas e nenhuma alteração na cor do indicador vermelho de fenol. Agar é um agente solidificante.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Esterilizar em autoclave usando um ciclo validado.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Mannitol Salt Agar são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, ou NBRC 13276

Para verificar capacidade inibitória:

Escherichia coli ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, ou NBRC 3972

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa Staphylococcus aureus.

Após o período de incubação recomendado, as placas devem mostram colônias isoladas em áreas com estrias e crescimento confluente em áreas de inoculação mais concentradas. Staphylococcus coagulase-positivos produz crescimento de colônias amarelas com zonas amarelas. Staphylococcus coagulase negativos produzem pequenas colônias vermelhas sem mudança de cor no meio. As maiorias das outras bactérias terão seu crescimento inibido.

Várias espécies de Staphylococcus além da S. aureus têm resultados positivos para o manitol e produzem colônias amarelas circundadas por zonas amarelas neste meio (por exemplo, S. capitis, S. xylosus, S. cohnii, S. sciuri, S. simulans e outras espécies). Por este motivo, é necessário realizar outros testes bioquímicos para a identificação de S. aureus ou de outras espécies. Consultar a bibliografia apropriada.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 6ª ed. 2019

Cetrimide Agar

Indicação de uso

O meio Cetrimide Agar, também conhecido como Agar Cetrimida, BD Pseudosel Agar, Pseudomonas Selective Agar, é usado para o isolamento seletivo da Pseudomonas aeruginosa. É amplamente recomendado para uso em exame de cosméticos, espécimes clínicos, para o ensaio de pesquisa de P. aeruginosa, bem como para avaliar a eficácia de desinfetantes contra este organismo. Também é usado no controle de qualidade microbiológico de produtos farmacêuticos não estéreis para Pseudomonas aeruginosa atendendo a Farmacopeia Brasileira (FB), Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), Farmacopeia Europeia (EP) e Farmacopeia Japonesa (JP).

A Pseudomonas aeruginosa é um micro-organismo ambiental e um importante agente patogênico nosocomial (hospitalar).

King, E.O., M.K. Ward and D.E. Raney desenvolveram o Meio A (Tech Agar) para o aumento da produção de piocianina por Pseudomonas. Cetrimide ágar tem a fórmula desenvolvida para o Tech Agar, mas é modificado pela adição de cetrimida (brometo de cetiltrimetilamina) para a inibição seletiva de organismos que não P. aeruginosa.

Em 1951, Lowbury descreveu o uso de 0,1% de cetrimida em um meio para P. aeruginosa. Devido à maior pureza do agente inibidor, a concentração foi posteriormente reduzida, relatado por Lowbury e Collins em 1955. Brown e Lowbury empregaram a incubação a 37° C com exame após 18 e 42 horas de incubação.

Cepas de P. aeruginosa são diferenciadas de outras espécies pela produção de piocianina, um composto poliaromático com alta capacidade redox pertencente à classe das fenazinas, e é um metabólito secundário que participa de vários processos biológicos. Está envolvida em aquisição de ferro, metabolismo energético, comunicação célula-célula, virulência e confere vantagem competitiva à bactéria. P. aeruginosa é a única espécie de Pseudomonas ou bacilo gram negativo conhecido por excretar a piocianina. O ágar Cetrimide, portanto, é um meio de cultura valioso na identificação deste organismo.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• Hidrolisado de pancreático de gelatina - 20,0 g
• Cloreto de magnésio - 1,4 g
• Sulfato dipotássico - 10,0 g
• Cetrimida - 0,3 g
• Agar - 13,6 g
• Glicerol - 10,0 mL

O pH final é 7.2 ± 0.2

O hidrolisado de pancreático de gelatina serve como fonte de nitrogênio e o glicerol é usado como fonte de carbono e energia. A produção de piocianina é estimulada pelo cloreto de magnésio e o sulfato de potássio presentes no meio. A cetrimida (brometo de cetiltrimetilamina) é um composto amônio quaternário, que inibe uma vasta variedade de outros organismos, incluindo outras espécies de Pseudomonas e organismos relacionados. O Agar é o agente solidificante.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Esterilizar em autoclave

usando um ciclo validado.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Cetrimide Agar são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, ou NBRC 13275

Para verificar capacidade inibitória:

Escherichia coli ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, ou NBRC 3972

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa Pseudomonas.

Colônias que são cercadas por um pigmento azul-esverdeado e apresentam fluorescência sob um comprimento de onda curto (254 nm), a luz ultravioleta podem ser presumivelmente identificadas como Pseudomonas aeruginosa. No entanto, certas cepas de P. aeruginosa podem não produzir piocianina. Outras espécies de Pseudomonas não produzem piocianina, mas apresentam fluorescência sob luz UV. A maioria das espécies que não são Pseudomonas é inibida, e algumas espécies de Pseudomonas também podem ser inibidas. Coloração de Gram, testes bioquímicos e procedimentos sorológicos devem ser realizados para confirmar os achados.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Nascimento, A.P.B. (USP - Universidade de São Paulo); Baldini, R.L. (USP - Universidade de São Paulo) - Análise das regiões regulatórias dos operons phz de Pseudomonas aeruginosa

Xylose Lysine Deoxycholate Agar

Indicação de uso

O meio Xylose Lysine Deoxycholate Agar, também conhecido como Agar XLD, Ágar de desoxicolato-lisina-xilose ou Ágar Xilose, Lisina, Desoxicolato, é um meio para diferenciação moderadamente seletivo utilizado para o isolamento e diferenciação de elementos patogênicos entéricos gram-negativos (Salmonella e Shigella) provenientes de amostras clínicas. É especialmente adequado para o isolamento de espécies de Shigella. Atende a Farmacopeia Brasileira (FB), Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), Farmacopeia Europeia (EP) e Farmacopeia Japonesa (JP) para o ensaio de pesquisa de Salmonella em produtos não estéreis.

O Ágar de XLD foi desenvolvido por W. I. Taylor no sentido de aumentar a eficiência do isolamento e da identificação de elementos patogênicos entéricos, particularmente de Shigella. Os elementos patogênicos diferenciam-se não só dos organismos fermentadores de lactose não patogênicos, mas também de muitos elementos não patogênicos que não fermentam a lactose nem a sacarose. Além disso, o meio foi formulado para melhorar o crescimento de Shigella, que frequentemente, noutras formulações, não se desenvolveu devido à inclusão de inibidores tóxicos. Os resultados obtidos numa série de avaliação clínica corroboraram a reivindicação sobre a eficácia relativamente elevada do Ágar de XLD no isolamento primário de Shigella e Salmonella.

O Ágar XLD é um meio seletivo e diferencial usado para o isolamento e diferenciação de patógenos entéricos. O valor do Agar XLD no laboratório clínico é que o meio é mais favorável a organismos entéricos fastidiosos como o Shigella. O XLD Agar também é recomendado para testes de alimentos, produtos lácteos e água em métodos de teste padrão para várias indústrias. O Capítulo Geral <62> da USP que descreve métodos para pesquisa de patógenos em produtos farmacêuticos não estéreis cita o ágar XLD como meio sólido para isolamento de Salmonella, bem como a Farmacopeia Brasileira em seu capitulo 5.5.3.1 - Ensaios Microbiológicos Para Produtos Não Estéreis.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• Xilose - 3,5 g
• L-Lisina - 5,0 g
• Lactose monoidratada - 7,5 g
• Sacarose - 7,5 g
• Cloreto de sódio - 5,0 g
• Extrato de levedura - 3,0 g
• Vermelho fenol - 80,0 mg
• Agar - 13,5 g
• Desoxicolato de sódio - 2,5 g
• Citrato de amônio férrico - 0,8 g
• Tiossulfato de sódio - 6,8 g

O pH final é 7.4 ± 0.2

O extrato de levedura age como fonte de nutrientes e vitaminas do complexo B. O desoxicolato de sódio é usado como agente seletivo e, por isso, possui uma ação inibitória em relação aos micro-organismos gram positivos. A xilose é incorporada no meio uma vez que é fermentada por praticamente todos os elementos entéricos, exceto pelas Shigellae, e esta característica permite a diferenciação das espécies de Shigella. A lisina é incluída de modo a permitir que o grupo de Salmonella seja diferenciado dos elementos não patogênicos uma vez que, sem a lisina, as salmonelas rapidamente fermentariam a xilose, tornando-se impossível distingui-las das espécies não patogênicas. Depois das salmonelas terem acabado com a fonte de xilose, a lisina é atacada através da enzima lisina descarboxilase, revertendo a um pH alcalino que imita a reação da Shigella. De modo a evitar que se dê uma inversão deste tipo por coliformes positivos à lisina, adiciona-se lactose e sacarose para produzir ácido em excesso. Para aumentar a capacidade de diferenciação da formulação, inclui-se um sistema de indicador de H₂S, composto por tiossulfato de sódio e citrato de amônia férrico, para a visualização do sulfureto de hidrogênio, resultando na formação de colônias com centros pretos. Os produtores de H₂S não patogênicos não descarboxilam a lisina; assim, a reação ácida que produzem impede que as colônias se tornem negras, o que acontece apenas com um pH neutro ou alcalino.

Degradação de xilose, lactose e sacarose gera produtos ácidos, causando uma mudança de cor no meio de vermelho para amarelo.

Produção de sulfeto de hidrogênio sob condições alcalinas resultam em colônias com centros negros. Esta reação é inibida pelas condições ácidas que acompanham a fermentação de carboidratos.

Descarboxilação da lisina na ausência de fermentação de lactose e sacarose provoca reversão para uma condição alcalina e a cor do meio muda de volta para vermelho.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Aquecer até a ebulição. Não esterilizar em autoclave.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento microbiano ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em XLD Agar são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Salmonella enterica ssp sorotipo typhimurium ATCC 14028 ou S. enterica ssp sorotipo abony NBRC 100797, NCTC 6017, ou CIP 80.39

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa Salmonella.

Quando há resultado positivo para Salmonella, as colônias crescem vermelho-amareladas com centros pretos.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth

Indicação de uso

O meio Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth, também conhecido como Caldo Enriquecimento Salmonella Rappaport Vassiliadis, é um meio de enriquecimento usado para selecionar Salmonella em amostras de alimentos e amostras ambientais. Atende a Farmacopeia Brasileira (FB), Farmacopeia Americana (USP), Farmacopeia Europeia (EP) e Farmacopeia Japonesa (JP) para o ensaio de pesquisa de Salmonella em produtos não estéreis.

Rappaport, Konforti e Navon formularam um meio de enriquecimento para Salmonella que incluía quantidades muito elevadas de verde malaquita e cloreto de magnésio como inibidores. O meio Rappaport original foi desenvolvido para o enriquecimento de S. paratyphi e outros sorotipos conhecidos por serem relativamente resistentes ao verde brilhante. Além disso, o cloreto de magnésio foi acrescentado para neutralizar o efeito tóxico do corante para Salmonella. Vassiliadis, Paternaki, Papaiconomon, Papadakis e Trichopoulos modificaram a formulação reduzindo a concentração de verde malaquita para um terço. Van Schothorst e Renaud relataram que o uso de peptona de soja em vez de peptona animal, melhorou as taxas de recuperação de Salmonella. Resultados semelhantes foram obtidos em vários outros estudos.

Este meio de enriquecimento apresenta seletividade para análise de pesquisa de salmonelas porque estas bactérias, incluindo outras espécies intestinais, são tipicamente inibidas pela presença de verde malaquita, por alta pressão osmótica e / ou pH baixo. S. typhi e S. paratyphi A são sensíveis ao verde malaquita e podem ter seu crescimento inibido.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Peptona de soja - 4,5 g
• Cloreto de magnésio hexaidratado - 29,0 g
• Cloreto de sódio - 8,0 g
• Fosfato de potássio dibásico - 0,4 g
• Fosfato de potássio monobásico - 0,6 g
• Verde malaquita - 36,0 mg 

O pH final é 5.2 ± 0.2

A peptona de soja é uma fonte de carbono e nitrogênio fornecendo requisitos gerais de crescimento. Cloreto de magnésio eleva a pressão osmótica no meio. Cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. Fosfato de potássio dibásico e Fosfato de potássio monobásico são agentes tamponantes. Verde Malaquita é inibidor de organismos que não sejam Salmonelas. O pH baixo do meio, combinado com a presença de verde malaquita e cloreto de magnésio, ajudam a alta seletividade para Salmonella spp.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Este meio deve ser autoclavado em temperatura que não exceda a 115°C, portanto é importante ter um ciclo validado nesta temperatura para a esterilização exclusiva do caldo Rappaport.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver turvação ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Salmonella enterica ssp sorotipo typhimurium ATCC 14028 ou S. enterica ssp sorotipo abony NBRC 100797, NCTC 6017, ou CIP 80.39

Para verificar a capacidade inibitória:

Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa Salmonella. Quando há resultado positivo, o meio torna-se turvo. No caso de resultado negativo, o meio permanece límpido, mantendo a coloração azul característica.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

MacConkey Agar

Indicação de uso

O MacConkey Agar é um meio seletivo utilizado principalmente para a detecção e isolamento de bactérias gram-negativas em amostras clínicas, lácteos, alimentos, água, farmacêuticas, cosméticos, entre outros segmentos industriais. Este meio é usado para isolar e diferenciar micro-organismos fermentadores de lactose de bacilos entéricos gram-negativos não fermentadores de lactose.

MacConkey Agar está em conformidade com as especificações dadas pelos métodos harmonizados de EP (Farmacopeia Europeia), USP (Farmacopeia Americana), JP (Farmacopeia Japonesa) e FB (Farmacopeia Brasileira) para Exame Microbiano de Produtos Não-Estéreis: Testes para Micro-organismos Especificados (Pesquisa de E. coli).

O meio MacConkey original foi usado para diferenciar cepas de Salmonella typhosa de membros do grupo coliforme. Modificações na fórmula melhoraram o crescimento da Shigella e cepas de Salmonella. Essas modificações incluíram a adição de cloreto de sódio a 0,5%, teor de ágar diminuído e concentrações de sais biliares e vermelho neutro alteradas. Essas melhorias na formulação resultaram em reações diferenciais melhoradas entre esses patógenos entéricos e o grupo coliforme.

MacConkey Agar contém cristal violeta e sais biliares que inibem o crescimento de organismos gram-positivos e permitem o crescimento de organismos gram-negativos. Colônias isoladas de bactérias do grupo coliforme apresentam coloração vermelha e podem estar rodeadas por uma zona de bílis precipitada (zona turva). Este precipitado de bile ocorre devido a uma queda de pH local em torno da colônia decorrente da fermentação de lactose. Colônias que não fermentam a lactose (como os bacilos tifoides, paratifóides e causadores de disenteria) permanecem incolores. Quando os não fermentadores de lactose crescem nas proximidades de coliformes, o meio circundante apresentam áreas limpas.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Hidrolisado de pancreático de gelatina – 17,0 g
• Peptona (carne ou caseína) - 3,0 g
• Lactose monoidratada - 10,0 g
• Cloreto de sódio - 5,0 g
• Bile de boi desidratada - 1,5 g
• Vermelho neutro - 30,0 mg
• Cristal violeta - 1,0 mg
• Agar - 13,5 g 

O pH final é 7.1 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

O hidrolisado de pancreático de gelatina e a peptona fornecem aminoácidos e outros fatores de crescimento. Sais biliares e cristal violeta inibem em grande parte o crescimento da microbiota gram-positiva. Lactose e o indicador de pH Vermelho neutro são usados para detectar a degradação da lactose. Bactérias fermentadoras de lactose baixam o pH do meio, de modo que há uma reação com o corante Vermelho neutro e as colônias crescem em tons de rosa a vermelho tijolo. Além disso, Escherichia coli e outras bactérias formadoras de ácido apresentam uma zona de sal biliar precipitado ao redor das colônias. Bactérias não fermentadoras de lactose crescem incolor ou apresentam colônias claras.

Ágar é o agente solidificante.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de colônias ou alteração de cor.

O micro-organismo citado pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Agar MacConkey de modo a verificar a seletividade é a cepa de Escherichia coli ATCC 8739.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio um pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa E. coli e coliformes totais. A produção de ácido faz com que a colônia fermentadora de lactose cresça com uma coloração de rosa a vermelho tijolo.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

MacConkey Broth

Indicação de uso

O MacConkey Broth, também conhecido como Caldo MacConkey é um meio de cultura seletivo utilizado como teste presuntivo para Escherichia coli e coliformes e para determinar a presença de Escherichia coli ou coliformes em amostras de leite, água e outros materiais de acordo com MacConkey e Hill (1901). Este meio está em conformidade com as especificações dadas pelos métodos harmonizados de EP, USP, JP para pesquisa de Coliformes Totais e E. coli em Produtos Não-Estéreis.

MacConkey Broth é uma modificação do caldo sal biliar original recomendado por Alfred MacConkey que continha 0,5% taurocolato de sódio e tornassol como indicador. Em publicações posteriores, MacConkey sugeriu variações desta formulação usando indicador vermelho neutro em vez de tornassol. Eileen Childs e L.A. Allen mostraram que algumas amostras de vermelho neutro exerceram efeito inibitório sobre o crescimento de Escherichia coli neste meio. O Púrpura de bromocresol é menos inibitório e a mudança de cor de púrpura para amarelo fornece uma indicação mais sensível e definida da formação de ácido. Oxgall (Bile bovina) no meio substitui o taurocolato de sódio original para inibir o crescimento de organismos gram-positivos.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Hidrolisado de pancreático de gelatina - 20,0 g
• Lactose monoidratada - 10,0 g
• Bile de boi desidratada - 5,0 g
• Púrpura de bromocresol - 10,0 mg 

O hidrolisado de pancreático de gelatina fornece aminoácidos e outros fatores de crescimento. Organismos que fermentam lactose crescem muito bem no Caldo MacConkey produzindo ácido, fazendo com que o meio fique amarelo devido à reação com o corante púrpura de bromocresol, que age como um indicador de pH. Também é produzido gás, que é coletado nos tubos de Durham em ensaios que utilizam a técnica de NMP (Número Mais Provável) com tubo invertido.

Os organismos não fermentadores apresentam um bom crescimento, mas não produzem ácidos ou gás.

A bile de boi promove o crescimento de várias espécies de bactérias intestinais e inibe a de micro-organismos, que não habitam o intestino, tais como bactérias gram positivas.

O pH final é 7.3 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver turvação ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Caldo MacConkey são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Escherichia coli ATCC 8739.

Para verificar a capacidade inibitória:

Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio um pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa E. coli e coliformes totais. A produção de ácido faz com que a cor do meio fique amarela em uma reação positiva, com produção de gás. Uma reação negativa resulta em nenhuma mudança de cor e o meio permanece púrpura.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Violet Red Bile Glucose Agar

Indicação de uso

O meio Violet Red Bile Glucose Agar, também conhecido como Crystal Violet Neutral Red Bile Glucose (Dextrose) agar e Ágar Violeta Vermelho Neutro Glicose é utilizado para a detecção e enumeração de Enterobacteriaceae em alimentos e ração animal e outros materiais. Também é listado na Farmacopeia Brasileira, United States Pharmacopeia (USP), European Pharmacopoeia (EP) e Japanese Pharmacopoeia (JP) como o meio sólido recomendado para uso no isolamento de bactérias gram-negativas bile tolerantes em produtos farmacêuticos não estéreis.

O grupo Enterobacteriaceae inclui bactérias fermentadoras de lactose, cepas não fermentadoras de lactose de E. coli, e espécies não fermentadoras de lactose, como Salmonella e Shigella. Ao examinar alguns alimentos, é desejável detectar Enterobacteriaceae em vez das bactérias do grupo coliformes.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Extrato de levedura - 3,0 g
• Digestivo Pancreático de Gelatina - 7,0 g
• Sais Biliares - 1,5 g
• Cloreto de sódio -5,0 g
• Glicose monoidratada -10,0 g
• Agar-15,0 g
• Vermelho neutro - 30,0 mg
• Cristal violeta - 2,0 mg 

Violet Red Bile Glucose Agar contém digestivo pancreático de gelatina como fonte de carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais. Extrato de levedura é um suplemento de vitaminas do complexo B que estimulam crescimento de bactérias. A glicose é um carboidrato. Sais biliares e cristal violeta inibem bactérias gram-positivas. A fermentação de glicose produz colônias vermelhas com halos vermelho-púrpura (precipitação biliar) na presença de vermelho neutro, um indicador de pH. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. Agar é o agente solidificante.

O pH final é 7.4 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. O meio deve ser aquecido com agitação frequente e fervido por não mais do que 2 minutos para dissolver completamente o pó. Este meio não deve ser autoclavado devido à presença de corante e bile.

Se o meio for utilizado imediatamente para a técnica de pour plate, deve ser resfriado a 44-47°C em banho-maria antes do uso. O meio fundido deve ser usado o mais rápido possível, não devendo ser retido por mais de 3 horas.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de colônias ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Violet Red Bile Glucose Agar são:

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027;

Escherichia coli ATCC 8739.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Obs.: Caso o analista queira testar a capacidade inibitória do meio frente a bactérias gram positivas, pode-se utilizar a cepa de Staphylococcus aureus ATCC 6538. Neste caso, após incubação, a placa deve apresentar nenhum ou pouquíssimo crescimento.

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo. Incubar Usando o método de pour plate, inocular e incubar a 35 ± 2°C durante 18-24 horas. Usando a técnica de estrias, inocular e incubar culturas a 30-35°C durante 18-24 horas. Enterobacteriaceae fermentam glicose, produzem ácidos formando colônias de vermelho a roxo escuro rodeadas de halos vermelho-púrpura. Certas Enterobacteriaceae podem causar descoloração de suas colônias ou do meio. Portanto, quando nenhuma colônia característica está presente, escolha colônias esbranquiçadas para confirmação.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010