Endotoxinas Bacterianas

No post de hoje, trago um texto sobre Endotoxinas bacterianas, escrito pela minha amiga Janaina Fernandes, Bióloga e Farmacêutica, que trabalhou muitos anos com esta análise e tem bem mais propriedade em escrever sobre o assunto do que eu. No laboratório terceirista em que trabalhamos, este ensaio não era realizado pela área de Microbiologia, da qual fui supervisora por 5 anos, havia um laboratório somente para a realização de ensaios de endotoxinas. A Janaina foi supervisora deste setor.

ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Todos os produtos estéreis, sejam injetáveis ou não, bem como suas matérias-primas ou materiais envolvidos na fabricação ou embalagem dos mesmos, tem por obrigatoriedade a realização do ensaio de endotoxinas bacterianas.

A Farmacopeia Brasileira 5ª edição define: O teste de endotoxina bacteriana é usado para detectar ou quantificar endotoxinas de bactérias gram negativas presentes em amostras para qual o teste é preconizado.

Utiliza-se o extrato aquoso dos amebócitos circulantes do Limulus polyphemus ou do Tachypleus tridentatus preparado e caracterizado como reagente LAL.

1.TÉCNICAS ANALÍTICAS

Há duas técnicas com sensibilidades diferentes para este teste:

1. MÉTODO DE COAGULAÇÃO EM GEL: baseado na formação de coágulo ou gel (método semi-quantitativo)

2. MÉTODOS FOTOMÉTRICOS quantitativos que incluem:

O MÉTODO TURBIDIMÉTRICO, (baseado no desenvolvimento de turbidez após quebra de um substrato endógeno);

O MÉTODO CROMOGÊNICO (baseado no desenvolvimento de cor após quebra de um complexo peptídeo sintético cromógeno).

Qualquer um destes procedimentos pode ser realizado, a menos que indicado contrário na monografia da substância.

Nota: As quantidades de endotoxinas são expressas em unidades de endotoxina (UE) definidas - 1 UE é igual a 1 UI (unidade internacional).

2. ANÁLISE SEMI-QUANTITATIVA

No método de coagulação em gel, a determinação do ponto final da reação é feita a partir de diluições da substância sob teste em comparação direta com diluições paralelas da endotoxina padrão.

Para a realização desta técnica utiliza-se tubos apirogênicos, micropipetas, ponteiras estéreis apirogênicas, banho-maria ou bloco aquecedor.

Faz-se a curva de calibração diluindo-se o padrão conforme a sensibilidade do lisado utilizado. ¼ , ½, 1 e 2x a sensibilidade do lisado.

Resultado esperado: ¼ (-), ½ (-), 1(+) e 2(+).

Negativo: gel frouxo ou semelhante à água (líquido)

Positivo: gel duro (não se desfaz)

Nota: cuidado ao virar o tubo, não deixar bater para não desestabilizar o gel e gerar um falso negativo.

3. ANÁLISE QUANTITATIVA

Atualmente no mercado, existem diversas marcas e técnicas para a realização da analise quantitativa.

Alguns utilizam placas de fundo chato (Elisa), seja por turbidimetria (turvação) ou cromogênico (formação de cores) o intuito é o mesmo, dizer exatamente quanto de endotoxinas possui a amostra preparada. É uma técnica muito mais precisa, mas exige treinamento do analista.

Deve-se tomar cuidado no preparo da curva de calibração, pipetagem, e alguns deles, o tempo que se leva para colocar o reagente, pois tudo isso pode influenciar no resultado final.

Normalmente, os resultados ficam armazenados no software e é possível localiza-los posteriormente.

Nota: cuidado ao adicionar os dados no sistema, senão a chance de erros de resultado é grande. Deve-se colocar a diluição utilizada ou a concentração final, dependendo o tipo de produto e a forma de expressão do resultado (limite de endotoxinas dado pela monografia).

4.LIMITE DE ENDOTOXINAS E CALCULO DE DILUIÇÃO

O limite de endotoxinas de cada matéria-prima é dado em monografias específicas, seja a Farmacopeia Brasileira, Americana, Japonesa, Britânica, enfim...

Em alguns casos é dado por EU/mg, EU/mL, EU/mg.

Se eu tenho uma monodroga, ou seja, um produto acabado que possui somente um ativo, posso utilizar o mesmo limite da matéria-prima?

Sim. Pode sim, uma vez que somente tem um ativo e normalmente diluído em água ultrapura.

Agora vamos falar somente em situações já conhecidas. Em outro post falaremos em situações onde eu não conheço o limite ou polidrogas.

Devemos fazer o calculo da diluição utilizando a seguinte formula:

MVD = limite de endotoxinas

         Sensibilidade do lisado

Observação: fórmula usada para quando o limite de endotoxina do fármaco especificado na monografia estiver em volume (UE/mL)

Onde:   M: máximo

            V: valor

            D: de diluição

Ou

MVD = limite de endotoxinas . concentração da amostra

                          Sensibilidade do lisado

Exemplos:

1.     Água purificada – limite de endotoxinas: 0,5EU/mL

Sensibilidade do lisado: 0,125EU/mL

MVD = limite de endotoxinas = 0,5 EU/mL = 4 , ou seja, podemos diluir até 4x ou 1:4

                Sens. Lisado           0,125EU/mL

2.     Solução de furosemida 10mg/mL – limite de endotoxinas (FB): 3,6EU/mg

Sensibilidade do lisado: 0,125EU/mL

MVD: limite de endotoxinas . concentração da amostra = 3,6EU/mg . 10mg/mL = 288 x

                      Sensibilidade do lisado                                     0,125EU/mL

Mais uma vez espero que este post ajude à elucidar dúvidas quanto ao ensaio de endotoxinas. Deixem seus comentários, opinião ou dúvidas!

Até a próxima.

Grow Promotion - Promoção de Crescimento em Meios de Cultura

Promoção de crescimento é um teste fundamental para o controle de qualidade dos meios de cultura utilizados na rotina laboratorial. Com ele podemos comprovar que o meio utilizado atende os requisitos à que se propõe e assegura o resultado final da análise.

No post de hoje, vou colocar de maneira sucinta como proceder corretamente com o teste de grow promotion, de modo a sanar possíveis dúvidas.

O que é Teste de Promoção de Crescimento?

É um teste que determina a adequação dos meios de cultura utilizados na rotina laboratorial e é usado por farmacopeias em todo o mundo. Verifica a capacidade que o meio tem em promover o crescimento microbiano.

A promoção de crescimento consiste em inocular organismos testes adequados ao tipo de meio.

Entende-se por organismo teste: Um conjunto de organismos teste deve conter micro-organismos com características estáveis, representativas de sua espécie e que sejam confiáveis para demonstrar o desempenho de um meio preparado no laboratório. Os organismos teste devem compreender as cepas que estejam facilmente disponíveis nas coleções de cultura de referência, porém cepas bem caracterizadas, isoladas no laboratório também podem ser incluídas.

Os organismos teste para cada meio pode incluir: 

• Cepas positivas robustas com características típicas;
• Cepas positivas que crescem fracamente (de uma natureza mais sensível);
• Cepas não reativas bioquimicamente;
• Cepas inibidas completamente.

Para os meios que não contêm indicadores ou agentes seletivos, o uso de uma cepa teste positiva simples, é adequado. Para os meios que contêm indicadores ou agentes seletivos, devem ser utilizadas cepas que demonstrem a função do indicador e seletividade. Para os meios complexos, como os adicionados de suplemento, cada lote deve ser verificado com as cepas que apresentem as características listadas acima.

Produtividade – Meios de cultura líquidos, semissólidos e sólidos devem ser inoculados com inóculos apropriados da cultura de trabalho dos organismos teste, utilizando um dispositivo adequado. Para métodos quantitativos a produtividade é a relação entre a contagem total de colônias no meio de cultura teste e contagem total de colônias no meio de cultura de referência.

Seletividade – Para a avaliação da seletividade em métodos quantitativos, utilizando dispositivos adequados e organismos teste definidos, um meio de cultura seletivo e um meio de referência são inoculados com inóculos apropriados dos organismos teste. Seletividade é a diferença entre a maior diluição, apresentando crescimento acima de 10 colônias, no meio de referência e a maior diluição, apresentando crescimento comparável, no meio teste.

Cuidado especial deve ser dado à seleção das amostras e organismos a serem avaliados nestes testes. Se organismos teste são utilizados na avaliação de meios não seletivos, os organismos escolhidos devem ser tão fastidiosos quanto àqueles para a qual o meio será utilizado rotineiramente. Recomenda-se que mais de um organismo teste seja utilizado para avaliar um determinado meio.

Para a avaliação de meios seletivos/diferenciais, devem ser escolhidos organismos que testem as características seletivas/diferenciais e de produtividade do meio. Meios líquidos podem ser avaliados utilizando organismos que devem crescer no meio e àqueles que devem ser reprimidos. Seguindo com uma incubação adequada, as concentrações devem ser determinadas para cada organismo teste. Um meio aceitável deve apresentar altas concentrações do organismo esperado e baixas concentrações do organismo reprimido. O desempenho de um novo lote deve ser similar ao lote controle. A avaliação de um meio sólido é realizada de uma maneira parecida.

Micro-organismos do grupo para qual o meio é designado devem ser recuperados, quantitativamente, quase comparado ao meio não seletivo. Organismos que devem ser reprimidos pelo meio, não podem se desenvolver ou devem ser fortemente reduzidos, ao se comparar com a enumeração do meio não seletivo.

Como escolher os organismos testes?

Metodologias (INCQS, AOAC) bem como as farmacopeias vigentes listam as cepas a serem testadas em cada meio recomendado em seus métodos como, por exemplo, o capitulo <61> da Farmacopeia Americana e o capitulo 5.5.3.1 da Farmacopeia Brasileira. Há uma tabela com a cepa, seu ATCC, o meio ao qual se aplica e o critério de aceitação.

Para alguns casos, além das cepas farmacopeicas, o analista pode utilizar micro-organismos “in house”, isolados ambientais do laboratório, fábrica ou outros. Para meios de cultura não farmacopeicos, pode-se tranquilamente utilizar os organismos que constam no certificado dos mesmos, bem como suas condições de incubação.

Quando e como realizar o teste de promoção de crescimento?

A promoção de crescimento deve ser realizada a cada lote produzido ou adquirido pronto. Assim o analista garante a qualidade de todos os ensaios conduzidos com estes meios. 

• É importante usar suspensões padronizadas das cepas testes e utilizar técnica de manutenção de forma que o inóculo não ultrapasse 5 passagens do cultivo original. Cultivar cada micro-organismo (bactéria e fungo) separadamente.
• Usar solução tampão cloreto de sódio-peptona pH - 7,0 ou solução tampão fosfato pH 7,2 para preparar as suspensões dos micro-organismos. Ao preparar a suspensão de esporos de A. brasiliensis, adicionar à solução tampão 0,05% de polissorbato 80.
• Usar as suspensões dentro de 2 horas ou dentro de 24 horas se mantidas à temperatura de 2-8º C.

Para realizar o teste, é necessário preparar inóculos das cepas a serem utilizadas, numa concentração que não ultrapasse a contagem de 100 UFC/ml. É importante utilizar um ágar não seletivo como um controle ao testar meios líquidos. Isso garante que o meio líquido foi inoculado com < 100 UFC.

Com os inóculos preparados e em temperatura ambiente, inocular nos meios a serem testados. O uso de pipetas calibradas é fundamental.

Para meios líquidos, basta pipetar o inóculo no tubo e agitar para uma homogeneização. No caso dos meios em placa, o analista deve pipetar o inóculo na placa e espalhar o mesmo com o auxilio de uma alça de Drigalsky. Incubar os meios nas condições recomendadas para análise de rotina.  Sempre levar em consideração a condições ambientais exigidas pelas diferentes espécies. Use os indicadores para se certificar que os ambientes anaeróbicos sejam mantidos.

Critérios de aceitação

Para caldos de enriquecimento, basta que haja turvação após a incubação comparando com um branco (meio estéril). Já para ágar de contagem, é preciso avaliar a recuperação. Quando eu atuava em laboratório, o parâmetro aceito era de no mínimo 70% de recuperação. Hoje, os critérios mudaram. A farmacopeia brasileira aceita uma recuperação mínima de 50%. Já a farmacopeia americana orienta: “para meio sólido, o crescimento obtido não deve diferir por um fator maior que 2 a partir do valor calculado para um inóculo padronizado. Isso se traduz em uma recuperação de 50% -200%. Em outras palavras, se inocular 50 UFC de um inóculo padronizado, uma recuperação entre 25-100 UFC é aceitável”. Cabe ao analista ou as diretrizes do laboratório escolher o critério que lhe pareça melhor.

Já para os meios seletivos, o crescimento dos micro-organismos devem apresentar as características de coloração descritas nas especificações, por exemplo: no ágar MacConkey, as colônias de coliformes fecais devem crescer com a coloração rosa a avermelhada, enquanto que bactérias não fermentadoras não devem apresentar coloração. Em contrapartida, não deve haver crescimento de colônias Gram positivas, como Staphylococcus aureus, pois o ágar MacConkey possui um inibidor de crescimento para tais bactérias.

Compare o crescimento no novo meio de cultura com o crescimento no meio previamente aprovado.O crescimento deve ser "comparável“.Em paralelo realizar o controle do inóculo em ágar não seletivo: deve haver ≤ 100 UFC. Nenhum fator de 2 é necessário. Agar Cetrimide é um meio de cultura altamente seletivo. O principal agente seletivo é a cetrimida.. Age como um detergente de amônio quaternário (QAC) e detergente catiônico. Inibe bactérias Gram-positivas e algumas Gram-negativas. É inibitório para Pseudomonas sp. mas não deve ser para P. aeruginosa. O Agar Cetrimide tende a ter um desempenho melhor se não for muito fresco (2 a 3 semanas após a fabricação). Executar teste paralelo no TSA demonstra conformidade (<100 UFC no TSA). A USP não limita o volume utilizado para o inóculo.

As recomendações são para executar uma validação completa do fornecedor de meio de cultura..Os resultados entre 2 fabricantes podem ser significativamente diferentes: os Auditores recomendam ter 2 fornecedores, para evitar qualquer atraso ou problema de qualidade..Três lotes de meios de cultura para teste. E se não houver lote previamente aprovado? Considere vários técnicos. Use um número significativo de replicatas. A média das médias pode ser considerada como ponto de referência.

Esterilidade dos meios

Uma quantidade adequada de cada lote deve ser testada para verificar possível contaminação microbiana, através da incubação sob condições apropriadas, antes do uso ou em paralelo com a utilização do meio de cultura. Limites para a porcentagem de placas, tubos ou frascos com meio líquido, devem ser estabelecidos para cada meio, ou especificados pelo fabricante. “Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 35 ± 1°C por 24 horas para o controle de esterilidade.”  Esterilidade Meios de cultura líquidos ou meios de cultura seletivos podem apresentar algumas dificuldades, devido à inibição de microrganismos. A contaminação pode não estar evidente visualmente, em forma de turbidez ou formação de colônia. Esta ocorrência pode ser superada através da transferência de uma porção do meio de cultura seletivo líquido para um meio de cultura não seletivo ou fazendo um swab da superfície da placa e incubando o swab em um meio não seletivo. “Não deve haver mudança de cor e nem crescimento de qualquer colônia.” 

Mais uma vez reforço a importância de documentar os dados obtidos. É um como um mantra em controle de qualidade. É imprescindível um POP que descreva como a promoção de crescimento deve ser realizada e documentada. Garante a rastreabilidade e não gera dúvidas em auditorias.

Espero que este post esclareça duvidas básicas. Deixem seus comentários! Afinal, o blog está aberto à discussões e melhorias.

Fontes:

brasil, ANVISA. Farmacopeia Brasileira 5ª ed. 2010

UNITED States Pharmacopeia. 37ª ed. 2014

PDS HPPC. Guia de Microbiologia 1ª ed. 2015 

Apresentação: Importância do Controle de Qualidade dos Meios de Cultura aplicados à Indústria Farmacêutic Ministrado por Leticia Dias - Workshop Unifar sobre meios de cultura 

Meios de Cultura

É de grande importância que o microbiologista saiba como preparar, testar a qualidade e utilizar de maneira correta os meios de cultura, afinal 99% das análises microbiológicas clássicas dependem do uso dos mesmos (acredito que só o ensaio de endotoxinas não requer o uso de meios). A escolha da marca e do tipo de meio vai fazer uma grande diferença no resultado final da análise. Quando eu era supervisora, todo estagiário ou analista novo começava no preparo dos meios, pois sabendo como preparar e realizar os controles de qualidade, o profissional terá uma compreensão melhor sobre o assunto.

No post de hoje, vou falar brevemente sobre os tipos de meios e os controles que devem ser aplicados aos mesmos, para garantir sua qualidade.

Tipos de Meios de Cultura     

Quanto à consistência:

• Líquido: é aquele em que nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa. Exemplo: Caldo Nutriente, TSB (Tryptic Soy Broth).
• Semissólido: este meio possui na sua composição, além dos nutrientes, ágar em uma pequena porcentagem (0,075 a 0,5 %), dando uma consistência intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas. Exemplo: Meio SIM (Sulfato Indol Motilidade).
• Sólido: é um meio que possui na sua composição nutrientes em torno de 15g de ágar/1.000 ml de água destilada. Exemplo: Agar Saboraud, TSA (Tryptic Soy Agar), Agar Nutriente.

Quanto à função:

• Meios de pré-enriquecimento: são aqueles que permitem a dessensibilização de microrganismos injuriados, para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou químico). Ex. Água peptonada, caldo lactosado (isolamento de salmonelas de leite em pó).
• Meios de Enriquecimento: quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros. Ex. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas (líquidos), Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens.
• Diferenciais: quando contém substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), Ágar MacConkey para a diferenciação de enterobactérias, Ágar sangue, ágar Baird-Parker para isolamento e diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos).
• Seletivos: os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. Exemplo: meios com telurito de potássio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae), ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey, meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella, meios com 7,5% de cloreto de sódio, meio Baird-Parker, para isolamento de Staphylococcus aureus, meios com antibióticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC, SFP, meio de Blaser, meio de Skirrow etc.). A maioria deles é também diferencial, permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microrganismos.
• Meios de triagem: meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro, meio Instituto Adolfo Lutz, uréia, etc.).
• Identificação: presta-se para a realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos à identificação (meios Oxidação/Fermentação, Ágar Citrato, Caldo nitrato, meio semissólido, caldo triptofano, meio de Sulfito Indol Motilidade etc.
• Dosagem: empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e aminoácidos;
• Contagem: empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (Agar de Contagem em Placas, TSC, Agar Batata Dextrose, Ágar Baird-Parker, etc.).
• Estocagem ou manutenção: utilizados para conservação de microrganismos no laboratório, garantem a viabilidade de microrganismos (Ágar Sabouraud, Meios com leite, Ágar suco de tomate, Ágar sangue, Ágar Simples, meio semissólido, etc.).

Quanto à Natureza:

• Animados: cultura celular
• Inanimados: natural (leite), sintéticos (Manitol Salt Agar) e semissintéticos (Ágar Sangue).

Preparação e Distribuição de Meios de Cultura

• Usar EPIs para o preparo de meios de cultura (máscaras, jaleco de manga longa e touca).
• Observar os riscos indicados nos rótulos dos frascos de meios de culturas e de reagentes químicos e fazer uso de EPIs específicos (máscaras, óculos de proteção e luvas).
• Usar vidrarias limpas, secas e sem trincos ou defeitos. Utilizar vidraria (balão de fundo chato, placa de Petri, tubo de ensaio, frasco, pipeta e outras Vidrarias auxiliares) em vidro neutro temperado, termo resistente com parede uniforme e reforçado.
• Esterilizar a vidraria pelo processo de calor seco (forno Pasteur) 170ºC por 120 minutos ou 180°C por 60 minutos ou por calor úmido seguindo o tempo qualificado da autoclave.
• Usar água destilada, deionizada, ou produzida por osmose reversa na preparação de meios de cultura e soluções.
• Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água.
• Os meios comerciais e preparados não comerciais devem ser pesados separadamente em papel manteiga e adicionados em uma vidraria adequada, hidratar em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido. Agitar firmemente por alguns segundos até obter uma suspensão homogênea. Escorrer o restante da água pela parede para retirar qualquer material aderente.
• Ajustar o pH dos meios preparados não comerciais com solução de HCl e NaOH 0,1N ou 1N. Nos meios contendo Ágar, pesar o Ágar separadamente e acrescentar após o ajuste do pH para não obstruir o eletrodo. O pH dos meios comerciais, normalmente, não precisa ser reajustado, mas deve ser verificado a cada lote. Alguns laboratórios verificam o pH apenas antes da esterilização. Outros, mais criteriosos, também verificam após. Para os meios líquidos, separe uma quantidade do lote preparado. No caso de meios sólidos, uma vez que não é possível usar o eletrodo, são isentos da verificação. Existe um eletrodo especifico para placas de Petri, mas eu pessoalmente nunca usei.
• Dissolver os meios líquidos e soluções com agitação e leve aquecimento (não abrir fervura).
• Aquecer os meios contendo Ágar até ferver com constante agitação. A parede da vidraria deve estar lisa sem pontos de Ágar. Caso observe pontos, a fervura não foi suficiente para a total dissolução. Retornar ao fogo para finalizar o procedimento. Caso não seja possível o aquecimento, recomento homogeneizar bem o meio antes de coloca-lo em cada frasco ou tubo, pois há o risco de que um recipiente contenha ágar em excesso e outro fique praticamente sem. Isto aplica-se quando se prepara 2 litros de meio em um béquer e o mesmo será subdividido em frascos de 250 ml, por exemplo.
• Sempre que for necessário o aquecimento dos meios, usar vidro termo resistente tipo Pyrex® e aquecer sobre a tela de amianto ou similar e tripé, no bico de Bunsen ou em placa aquecedora.
• Usar sempre luvas térmicas apropriadas para laboratório para manipular vidrarias quentes.
• Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilização deve ser o tempo validado da autoclave quando o equipamento for qualificado. Embora a recomendação geral dos fabricantes seja de 15 minutos à 121ºC, esse tempo varia de equipamento para equipamento, e com o passar do tempo, o mesmo equipamento pode apresentar uma variação, sendo necessário verificar esse tempo quando for realizada a qualificação. Alguns meios também possuem temperaturas especificas, como por exemplo, o caldo Rappaport Vassiliadis, utilizado para pesquise de Salmonella, que requer autoclavação à 115ºC, deste modo é necessário validar um ciclo da autoclave somente para ele.
• Sempre que for usado o termo “esterilizar por filtração”, usar membrana composta por ésteres de celulose ou polímeros plásticos e com porosidade de 0,22μm de diâmetro, recomendado para reter partículas bacterianas. A esterilização por filtração é utilizada quando o material é sensível ao calor, como alguns meios de cultura, soluções de açúcares, soluções de antibióticos e outros.
• Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados.
• Quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estéreis.
• Os meios devem ser autoclavados com as tampas semiabertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor. Vale reforçar a montagem adequada da carga, de modo que permita a circulação de vapor entres os frascos e tubos. Cargas muito cheias podem não ser esterilizadas de modo adequado.
• Meios sólidos que precisam ser plaqueados, geralmente são dissolvidos em micro-ondas ou até mesmo em autoclave, depende da rotina do laboratório, e uma vez dissolvidos, o ideal é mantê-los em banho maria até o uso. Em algumas discussões recentes, li que o INMETRO tem exigido um controle rígido da temperatura dos meios dissolvidos, baseado em informações encontradas no Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Eles recomendam medir a temperatura antes do plaqueamento, pois se o meio estiver muito quente, pode matar os microrganismos presentes na amostra ou inóculo. A temperatura recomendada é de 45 a 50ºC.

Controle de Qualidade de Esterilidade e Crescimento

• Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 30 a 35°C por 24 horas para o controle de esterilidade.
• Não deve haver mudança de cor nem crescimento de qualquer colônia.
• Para o controle de crescimento (grow promotion), sempre que possível usar cepas ATCC, que são cepas de referências de origem e padrão definido de provas para a sua caracterização.
• Se não for possível o uso de cepas ATCC, usar cepas 100% positivas para os controles de qualidade de crescimento realizados.
• Controlar a eficácia da autoclave ou estufa, realizando semanalmente testes biológicos para essa finalidade. Os testes biológicos para autoclaves a vapor são os que contêm 10⁶ Geobacillus stearothermophilus e os testes biológicos para estufa de calor seco contêm 10⁶ Bacillus subtilis.

Obs.: O Grow promotion é um teste de grande importância, tanto que merece um post dedicado a ele.

Recomendações Gerais

• Evitar usar meios vencidos (liofilizados e prontos para uso).
• Não usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados.
• Observar com atenção para as instruções de alguns inóculos que são específicos para alguns meios de cultura.
• Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rápido do meio.
• Evitar o uso de sacos plásticos para embalar as placas, pois a água de condensação formada facilita a proliferação de fungos.
• Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de fabricação, data de validade e tipo de armazenamento. Manter registros bem detalhados facilita a rastreabilidade dos dados e futuros questionamentos em auditorias. No caso de frascos, não colocar a identificação somente na tampa, eu recomendo colocar no frasco, pois o analista pode trocar acidentalmente a tampa e causar confusão. Eu identificava meios liberados para uso com uma etiqueta verde e os que estavam em quarentena com uma etiqueta vermelha, tanto na tampa, quanto no frasco. No caso de tubos, identificar a estante e cada tubo de ensaio seria o ideal, mas para grandes quantidades de tubos, identificar a estante de modo a não gerar dúvidas de qual o meio contido nos tubos.

Fabricar os meios ou compra-los prontos?

Essa questão vai da capacidade do laboratório e a demanda de análises rotineiras. A fabricação permite um bom controle dos seus meios de cultura, mas é uma tarefa que impacta na rotina, uma vez que se não houver um funcionário dedicado à preparação, um analista terá que parar suas análises para prepara-los e realizar todo o controle. Existem boas opções prontas no mercado, que podem suprir as necessidades diárias. Cabe uma análise cuidadosa de custo beneficio.

Qual o meio mais adequado para minha análise?

Existe uma gama infinita de meios de cultura disponível hoje no mercado. A escolha do meio apropriado vai do analista ou das diretrizes da empresa. Geralmente os laboratórios seguem métodos compendiais ou instruções normativas, que dispensa a validação dos mesmos, segundo a Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003. Mas nada impede que o analista escolha um meio diferente do método compendial e que lhe pareça mais adequado. Basta validar este meio frente ao meio indicado na metodologia de modo a comprovar que os resultados obtidos serão os mesmo para ambos.

Enfim, este assunto é extenso, e como já havia escrito aqui eu fiz um resumo. Qualquer dúvida sintam-se a vontade e deixem suas sugestões nos comentários.

Fontes:

Ribeiro, M.C.; soares, M.M.S.R. - Microbiologia Prática – Roteiro e Manual

brasil, ANVISA - Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à

Assistência à Saúde

BRASIL. Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003 Determina a publicação do "Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos", publicado no Diário Oficial da União; Poder Executivo, de 02 de junho de 2003.

Manutenção de Cepas Microbianas

Tenho acompanhado em grupos de microbiologia dúvidas em relação à manutenção de cepas microbianas. Isso é um ponto muito importante na rotina de um laboratório, uma vez que as cepas são utilizadas para o grow promotion, bem como para testes de desafio de conservantes, validações de sanitizantes e de métodos.

Com base nisto, estou criando este post para esclarecer parte destas dúvidas e quem sabe começar uma discussão para troca de experiências.

As três perguntas mais frequentes

• Quantas vezes posso repicar meus microrganismos?
• Posso congelar meus microrganismos?
• Como eu posso manter meus microrganismos?

Quantas vezes posso repicar meus microrganismos?

Existem limitações:

• O tipo de teste pode limitar o número de passagens;
• O risco de mutações, limita o número de repiques.

Os repiques ou passagens significam que os microrganismos estão sendo transferidos de um meio para outro.

O tipo de teste pode limitar o número de passagens

• Microrganismos usados em teste baseado na farmacopeia, como promoção de crescimento e teste de eficácia de conservantes não devem ter mais do que 5 passagens a partir da cultura de referência.

Aqui vale lembrar a importância de verificar com seu fornecedor em que geração está sua cepa de referência, para que você saiba até quando você pode usá-la.

O risco de mutações, limita o número de repiques

• É recomendável a conservação de repiques mínimos. A 9ª edição do Manual de Microbiologia Clínica alerta, "Cada transferência de um novo repique aumenta a probabilidade de mutações com indesejáveis chances de mudanças na característica do microrganismo.

Mutações ocorrem:

• Aleatoriamente;
• Frequentemente devido ao alto nível de replicações (por exemplo, sob condições ideais uma cepa de Staphylococcus pode se dividir a cada 30 minutos).

Importante:

Laboratórios precisam revisar seus processos de gerenciamento e preservação no controle de processos de cepas e no trabalho com culturas porque:

• Variações genéticas podem afetar fenotipicamente e fisiologicamente traços da cepa ao longo do tempo;
• Variações genéticas podem ter um impacto significante nos métodos moleculares e no resultado de análises.

Possíveis ramificações das cepas mutantes

• Falha nos testes de meios seletivos;
• Resultados incorretos de susceptibilidade;
• Identificação incorreta de isolados;
• Falhas nas auditorias e perda de certificações;
• Perda de clientes.

Posso congelar os meus microrganismos?

Não é um processo recomendado porque:

• Existe alto risco de mutação neste processo;
• Congelamento tem alto custo.

Risco de mutações

• Congelamento de microrganismos a -20ºC podem danificar a célula do mesmo devido a formação de cristais de gelo e flutuações eletrolíticas;
• Podem também ocorrer danos na célula durante o descongelamento;
• Considera-se temperaturas críticas entre -40ºC e -5ºC;
• Aquecimento indesejado, pode ocorrer com perda de energia e consequentemente danificar as células dos microrganismos

Congelamento tem alto custo

Os custos incluem:

• Baixas temperaturas;
• Gerador para sistemas de back-up;
• Frascos especiais para congelamento e armazenamento;
• Sistema de alarme em caso de queda de energia;
• Obrigatório (tempo gasto para a validação de métodos de congelamento, descongelamento, congelamento, etiquetagem, manutenção de registros etc;
• Retestes e análises de causa raiz, caso ocorra mutações.

Obs.: O congelamento não é um método proibido, mas que gera custos, uma vez que o ideal é o uso de um ultrafreezer (que congela a -80ºC). É um equipamento por si só caro, e como exposto acima, requer um controle rígido de queda de temperatura em caso de falta de energia. É preciso avaliar com cuidado se o seu laboratório tem condições de manter as cepas congeladas adequadamente.

Regras simples para estocar microrganismos

• Indica-se a armazenagem de bactérias aeróbias em temperaturas entre 2-8ºC (poucas espécies de Bacillus irão permanecer viáveis por longos períodos, quando estocados em temperatura ambiente);
• Indica-se o armazenamento de cepas que requerem CO2, à temperatura ambiente em jarras de anaerobiose com gerador;
• Leveduras e bolores devem ser armazenadas em temperatura ambiente (lembrando que a temperatura do laboratório deve ser controlada de acordo com a BPF);
• Pode se armazenar cepas anaerobias e aeróbias à temperatura entre 2-8ºC;
• Não testar colônias da placa ou slant originais. Este é o local sobre o qual o sedimento liofilizado foi iniciado. Os organismos que crescem neste local não estão totalmente viáveis;
• Sempre utilizar microrganismos frescos para realização dos testes;
• Muitos testes exigem que os microrganismos não tenham mais do que 24 horas;
• Sempre selecione colônias isoladas para o seu teste;
• Estocar o microrganismo em meios de cultura adequados ao mesmo (bactérias em TSA ou agar nutriente e fungos em SDA). No caso de cepas de Clostridium pode-se usar o caldo Reinforced Clostridial Medium. 

Uma última consideração é a importância de adquirir cepas de fornecedores qualificados e manter registros atualizados de seu cepario. Como tudo na rotina laboratorial, tudo deve ser documentado e possuir certificados, para não gerar dúvidas em auditorias e manter a rastreabilidade de dados em caso de uma investigação em um desvio analítico. As cepas adquiridas devem vir com certificados e instruções que garantam o uso correto das mesmas.

Espero que este artigo seja útil para esclarecer dúvidas básicas. Caso surjam outras, toda discussão é válida!

Fonte: Catálogo Plastlabor