MacConkey Agar

Indicação de uso

O MacConkey Agar é um meio seletivo utilizado principalmente para a detecção e isolamento de bactérias gram-negativas em amostras clínicas, lácteos, alimentos, água, farmacêuticas, cosméticos, entre outros segmentos industriais. Este meio é usado para isolar e diferenciar micro-organismos fermentadores de lactose de bacilos entéricos gram-negativos não fermentadores de lactose.

MacConkey Agar está em conformidade com as especificações dadas pelos métodos harmonizados de EP (Farmacopeia Europeia), USP (Farmacopeia Americana), JP (Farmacopeia Japonesa) e FB (Farmacopeia Brasileira) para Exame Microbiano de Produtos Não-Estéreis: Testes para Micro-organismos Especificados (Pesquisa de E. coli).

O meio MacConkey original foi usado para diferenciar cepas de Salmonella typhosa de membros do grupo coliforme. Modificações na fórmula melhoraram o crescimento da Shigella e cepas de Salmonella. Essas modificações incluíram a adição de cloreto de sódio a 0,5%, teor de ágar diminuído e concentrações de sais biliares e vermelho neutro alteradas. Essas melhorias na formulação resultaram em reações diferenciais melhoradas entre esses patógenos entéricos e o grupo coliforme.

MacConkey Agar contém cristal violeta e sais biliares que inibem o crescimento de organismos gram-positivos e permitem o crescimento de organismos gram-negativos. Colônias isoladas de bactérias do grupo coliforme apresentam coloração vermelha e podem estar rodeadas por uma zona de bílis precipitada (zona turva). Este precipitado de bile ocorre devido a uma queda de pH local em torno da colônia decorrente da fermentação de lactose. Colônias que não fermentam a lactose (como os bacilos tifoides, paratifóides e causadores de disenteria) permanecem incolores. Quando os não fermentadores de lactose crescem nas proximidades de coliformes, o meio circundante apresentam áreas limpas.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Hidrolisado de pancreático de gelatina – 17,0 g
• Peptona (carne ou caseína) - 3,0 g
• Lactose monoidratada - 10,0 g
• Cloreto de sódio - 5,0 g
• Bile de boi desidratada - 1,5 g
• Vermelho neutro - 30,0 mg
• Cristal violeta - 1,0 mg
• Agar - 13,5 g 

O pH final é 7.1 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

O hidrolisado de pancreático de gelatina e a peptona fornecem aminoácidos e outros fatores de crescimento. Sais biliares e cristal violeta inibem em grande parte o crescimento da microbiota gram-positiva. Lactose e o indicador de pH Vermelho neutro são usados para detectar a degradação da lactose. Bactérias fermentadoras de lactose baixam o pH do meio, de modo que há uma reação com o corante Vermelho neutro e as colônias crescem em tons de rosa a vermelho tijolo. Além disso, Escherichia coli e outras bactérias formadoras de ácido apresentam uma zona de sal biliar precipitado ao redor das colônias. Bactérias não fermentadoras de lactose crescem incolor ou apresentam colônias claras.

Ágar é o agente solidificante.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de colônias ou alteração de cor.

O micro-organismo citado pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Agar MacConkey de modo a verificar a seletividade é a cepa de Escherichia coli ATCC 8739.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio um pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa E. coli e coliformes totais. A produção de ácido faz com que a colônia fermentadora de lactose cresça com uma coloração de rosa a vermelho tijolo.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

MacConkey Broth

Indicação de uso

O MacConkey Broth, também conhecido como Caldo MacConkey é um meio de cultura seletivo utilizado como teste presuntivo para Escherichia coli e coliformes e para determinar a presença de Escherichia coli ou coliformes em amostras de leite, água e outros materiais de acordo com MacConkey e Hill (1901). Este meio está em conformidade com as especificações dadas pelos métodos harmonizados de EP, USP, JP para pesquisa de Coliformes Totais e E. coli em Produtos Não-Estéreis.

MacConkey Broth é uma modificação do caldo sal biliar original recomendado por Alfred MacConkey que continha 0,5% taurocolato de sódio e tornassol como indicador. Em publicações posteriores, MacConkey sugeriu variações desta formulação usando indicador vermelho neutro em vez de tornassol. Eileen Childs e L.A. Allen mostraram que algumas amostras de vermelho neutro exerceram efeito inibitório sobre o crescimento de Escherichia coli neste meio. O Púrpura de bromocresol é menos inibitório e a mudança de cor de púrpura para amarelo fornece uma indicação mais sensível e definida da formação de ácido. Oxgall (Bile bovina) no meio substitui o taurocolato de sódio original para inibir o crescimento de organismos gram-positivos.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Hidrolisado de pancreático de gelatina - 20,0 g
• Lactose monoidratada - 10,0 g
• Bile de boi desidratada - 5,0 g
• Púrpura de bromocresol - 10,0 mg 

O hidrolisado de pancreático de gelatina fornece aminoácidos e outros fatores de crescimento. Organismos que fermentam lactose crescem muito bem no Caldo MacConkey produzindo ácido, fazendo com que o meio fique amarelo devido à reação com o corante púrpura de bromocresol, que age como um indicador de pH. Também é produzido gás, que é coletado nos tubos de Durham em ensaios que utilizam a técnica de NMP (Número Mais Provável) com tubo invertido.

Os organismos não fermentadores apresentam um bom crescimento, mas não produzem ácidos ou gás.

A bile de boi promove o crescimento de várias espécies de bactérias intestinais e inibe a de micro-organismos, que não habitam o intestino, tais como bactérias gram positivas.

O pH final é 7.3 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver turvação ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Caldo MacConkey são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Escherichia coli ATCC 8739.

Para verificar a capacidade inibitória:

Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio um pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo teste. Incubar na temperatura e tempo especificados no ensaio de pesquisa E. coli e coliformes totais. A produção de ácido faz com que a cor do meio fique amarela em uma reação positiva, com produção de gás. Uma reação negativa resulta em nenhuma mudança de cor e o meio permanece púrpura.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Violet Red Bile Glucose Agar

Indicação de uso

O meio Violet Red Bile Glucose Agar, também conhecido como Crystal Violet Neutral Red Bile Glucose (Dextrose) agar e Ágar Violeta Vermelho Neutro Glicose é utilizado para a detecção e enumeração de Enterobacteriaceae em alimentos e ração animal e outros materiais. Também é listado na Farmacopeia Brasileira, United States Pharmacopeia (USP), European Pharmacopoeia (EP) e Japanese Pharmacopoeia (JP) como o meio sólido recomendado para uso no isolamento de bactérias gram-negativas bile tolerantes em produtos farmacêuticos não estéreis.

O grupo Enterobacteriaceae inclui bactérias fermentadoras de lactose, cepas não fermentadoras de lactose de E. coli, e espécies não fermentadoras de lactose, como Salmonella e Shigella. Ao examinar alguns alimentos, é desejável detectar Enterobacteriaceae em vez das bactérias do grupo coliformes.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Extrato de levedura - 3,0 g
• Digestivo Pancreático de Gelatina - 7,0 g
• Sais Biliares - 1,5 g
• Cloreto de sódio -5,0 g
• Glicose monoidratada -10,0 g
• Agar-15,0 g
• Vermelho neutro - 30,0 mg
• Cristal violeta - 2,0 mg 

Violet Red Bile Glucose Agar contém digestivo pancreático de gelatina como fonte de carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais. Extrato de levedura é um suplemento de vitaminas do complexo B que estimulam crescimento de bactérias. A glicose é um carboidrato. Sais biliares e cristal violeta inibem bactérias gram-positivas. A fermentação de glicose produz colônias vermelhas com halos vermelho-púrpura (precipitação biliar) na presença de vermelho neutro, um indicador de pH. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. Agar é o agente solidificante.

O pH final é 7.4 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. O meio deve ser aquecido com agitação frequente e fervido por não mais do que 2 minutos para dissolver completamente o pó. Este meio não deve ser autoclavado devido à presença de corante e bile.

Se o meio for utilizado imediatamente para a técnica de pour plate, deve ser resfriado a 44-47°C em banho-maria antes do uso. O meio fundido deve ser usado o mais rápido possível, não devendo ser retido por mais de 3 horas.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de colônias ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em Violet Red Bile Glucose Agar são:

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027;

Escherichia coli ATCC 8739.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Obs.: Caso o analista queira testar a capacidade inibitória do meio frente a bactérias gram positivas, pode-se utilizar a cepa de Staphylococcus aureus ATCC 6538. Neste caso, após incubação, a placa deve apresentar nenhum ou pouquíssimo crescimento.

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo. Incubar Usando o método de pour plate, inocular e incubar a 35 ± 2°C durante 18-24 horas. Usando a técnica de estrias, inocular e incubar culturas a 30-35°C durante 18-24 horas. Enterobacteriaceae fermentam glicose, produzem ácidos formando colônias de vermelho a roxo escuro rodeadas de halos vermelho-púrpura. Certas Enterobacteriaceae podem causar descoloração de suas colônias ou do meio. Portanto, quando nenhuma colônia característica está presente, escolha colônias esbranquiçadas para confirmação.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Enterobacteria Enrichment Broth Mossel

Indicação de uso

O meio EE Broth Mossel Enrichment, também conhecido como Caldo de Enriquecimento de Enterobactérias segundo Mossel é utilizado para o cultivo e enriquecimento de Enterobacteriaceae em alimentos em ambiente de laboratório. O caldo EE Mossel não se destina ao uso no diagnóstico de doenças ou outras condições em seres humanos. O caldo EE Mossel está de acordo com os Requisitos Harmonizados da USP / EP / JP para pesquisa de bactérias gram-negativas bile tolerantes em produtos farmacêuticos não estéreis.

O caldo de EE Mossel Enrichment é preparado de acordo com a fórmula Mossel, Visser e Cornelissen. A fórmula contém dextrose para facilitar o crescimento da maioria das Enterobacteriaceae, assegurar a detecção de Salmonella e outros organismos negativos para lactose. O caldo de EE Mossel Enrichment deve ser usado como caldo de enriquecimento, seguido de um meio seletivo; por exemplo, Violet Ágar Biliar Vermelho.

A enumeração de Enterobacteriaceae é de grande preocupação em monitorar a condição sanitária dos alimentos. Enterobacteriaceae podem ser injuriadas em procedimentos de processamento de alimentos, que incluem exposição a baixas temperaturas, calor sub-marginal, secagem, radiação, conservantes ou desinfetantes. A recuperação depende de uma ressuscitação adequada de células danificadas. O EE Caldo Enriquecimento Mossel é usado para detectar e enumerar Enterobacteriaceae encontrados por mililitro ou por grama de amostra de teste de alimentos ao pela Técnica de Número Provável (MPN) com pré-enriquecimento. Em amostras de produtos farmacêuticos, é usado como meio de pré-enriquecimento para detecção de Bactérias Gram Negativas Bile Tolerantes.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Hidrolisado de pancreático de gelatina - 10,0 g
• Dextrose - 5,0 g
• Bile de boi desidratada - 20,0 g
• Fosfato de potássico monobásico- 2,0 g
• Fosfato dissódico didratado - 8,0 g
• Verde brilhante - 15,0 mg 

O hidrolisado de pancreático de gelatina é uma fonte complexa de nitrogênio. A dextrose favorece o crescimento de todas as Enterobacteriaceae positivas e negativas à lactose. A bile bovina inibe bactérias gram-positivas enquanto as bactérias gram-negativas indesejadas são inibidas pelo verde brilhante. O forte tamponamento do meio de cultura pelos sais fostato impede que o ácido formado mate a cultura.

O pH final é 7.2 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Aqueça a 100°C em banho-maria ou vapor fluído durante 30 minutos e esfriar imediatamente. Este meio não deve ser autoclavado devido à presença de corante e bile.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver turvação ou alteração de cor.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em EE Broth Mossel Enrichment são:

Para promoção de crescimento (verificar a seletividade):

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027;

Escherichia coli ATCC 8739.

Para verificar a capacidade inibitória:

Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Outros micro-organismos podem ser inoculados, de acordo com a metodologia usada.  

Inocule no meio pequeno número (não mais de 100 UFC) do micro-organismo. Incubar na temperatura especificada por não mais do que o menor período de tempo especificado no ensaio de pesquisa de bactérias gram negativas bile tolerantes. A produção de ácido faz com que a cor do meio EE Mossel fique amarela em uma reação positiva. Uma reação negativa resulta em nenhuma mudança de cor e o meio permanece verde.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Sabouraud Dextrose Agar (SDA)

Indicação de uso

O meio SDA – Sabouraud Dextrose Agar é usado para o isolamento, cultivo e manutenção de espécies não patogênicas e patogênicas de bolores e leveduras. O SDA foi formulado por Raymond Sabouraud em 1892 para cultura de dermatófitos. O pH é ajustado para aproximadamente 5,6 para aumentar o crescimento de fungos, especialmente dermatófitos, e inibir ligeiramente o crescimento bacteriano em amostras clínicas. É o meio descrito em métodos farmacopeicos para enumeração de fungos em amostras de fármacos, cosméticos, alimentos etc. Em monitoramento ambiental, é usado para a detecção e enumeração de fungos em superfícies, manipuladores e ambientes controlados. Também é um meio indicado para a manutenção de cepas de bolores e leveduras para rotina laboratorial.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• Dextrose – 40 g
• Digestão Péptica de Tecido Animal - 5 g
• Digestão pancreática de caseína- 5 g
• Agar – 15 g

Peptonas fornecem nitrogênio e vitaminas necessárias para o crescimento do organismo no Ágar Sabouraud Dextrose. A alta concentração de dextrose serve como fonte de energia. O ágar é o agente solidificante.

O pH final é 5.6 ± 0.2. Alguns fungos podem ser inibidos pelo pH ácido do meio.

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

É importante evitar o superaquecimento do meio com um pH ácido, pois pode degradar o meio.

Alguns suplementos podem ser adicionados ao preparo do meio para inibir o crescimento de micro-organismos indesejados. Temos como exemplos de suplementos a gentamicina (um antibiótico aminoglicosídeo que inibe a crescimento de bactérias gram-negativas), cloranfenicol, que inibe a uma ampla gama de bactérias gram-negativas e gram-positivas, e cicloheximida que é um agente antifúngico que principalmente ativo contra fungos saprófitas e não inibe leveduras ou dermatófitos.

Também podem ser adicionados lecitina de soja para neutralizar compostos de amônio quaternário, e polissorbato 80 para neutralizar desinfetantes fenólicos. Essa neutralização é importante para monitoramento ambiental.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Os compêndios trazem uma lista com os microrganismos a serem inoculados para o teste de grow promotion (também conhecido como teste de promoção de crescimento ou capacidade nutritiva dos meios de cultura). Outros micro-organismos, como cepas in house podem ser inoculados também de modo a comprovar a capacidade do meio de recuperar os mesmos. Inocular menos que 100 UFC do micro-organismo teste ao meio. Incubar à temperatura adequada e observar o crescimento visível comparando com um controle (branco) do mesmo meio de cultura.

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de micro-organismos.

Os micro-organismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em SDA são:

Candida albicans ATCC 10231;

Aspergillus brasiliensis ATCC 16404.

Após inoculação, as condições de incubação são temperatura de 20º a 25ºC por 2-5 dias.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Tryptic Soy Broth (TSB)

Indicação de uso

O meio TSB – Tryptic Soy Broth, também conhecido como Soybean-Casein Digest Broth, Caldo Caseína Soja ou Caldo Digestão Enzimática de Caseína-Soja é o meio de escolha dos métodos farmacopeicos para diversos ensaios, tais como Teste de Esterilidade, Contagem de Microrganismos Mesofílicos (também chamado de Bioburden em alguns laboratórios), pesquisa de patógenos em diversos seguimentos, como indústria farmacêutica, cosmética, alimentos etc. Pode ser usado como meio enriquecedor para recuperação de micro-organismos para isolamento e identificação.

Em testes de Media Fill, é o meio de escolha para substituir o produto, de modo a simular operações assépticas para assegurar que os processos utilizados são capazes de produzir produtos estéreis.  

O TSB foi escolhido pela USDA Animal and Plant Health Inspection Service para detecção de bactérias viáveis em vacinas vivas.

Devido à sua capacidade de promoção de crescimento, o TSB também é recomendado para uso como caldo de inóculo para difusão de disco e ágar teste de sensibilidade antimicrobiana por diluição, conforme Instituto de Normas Clínicas e Laboratoriais (CLSI).

TSB é um meio nutritivo que permite o crescimento de uma ampla variedade de micro-organismos, incluindo bactérias aeróbicas, facultativas e anaeróbicas comuns e fungos.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro 

• Peptona de caseína pancreática – 17 g
• Farinha de soja obtida por digestão papaínica - 3 g
• Cloreto de Sódio - 5 g
• Fosfato de Potássio Dibásico – 2,5 g
• Dextrose – 2,5 g 

Digestões enzimáticas de caseína e soja fornecem aminoácidos e outras substâncias nitrogenadas complexas. Dextrose é uma fonte de energia. Cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. O fosfato de potássio dibásico age como um tampão para controlar o pH.

O pH final é 7.3 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

Algumas modificações na formulação permitem diversificar o uso deste meio tão versátil. A adição de 6,5% de cloreto de sódio ao TSB permite a diferenciação de enterococos tolerantes ao sal, que são resistentes ao alto teor de sal, da intolerância ao sal do grupo S. bovis e outras espécies de estreptococos. Nesta concentração, o cloreto de sódio é um agente seletivo que interfere com permeabilidade de membrana osmótica e equilíbrio eletrocinético. Fildes Enrichment é uma digestão péptica de sangue de ovelha que fornece o X (heminina) e V (dinucleotídeo de nicotinamida adenina, NAD) fatores necessários para o crescimento de H. influenzae. A dextrose é omitida da fórmula do TSB para permitir o uso do meio em estudos de fermentação. A concentração de carboidratos usada com mais frequência nas reações de fermentação é de 0,5% ou 1%.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Os compêndios trazem uma lista com os microrganismos a serem inoculados para o teste de grow promotion (também conhecido como teste de promoção de crescimento ou capacidade nutritiva dos meios de cultura). Outros micro-organismos, como cepas in house podem ser inoculados também de modo a comprovar a capacidade do meio de recuperar os mesmos. Inocular menos que 100 UFC do micro-organismo teste ao meio. Incubar à temperatura adequada e observar o crescimento visível comparando com um controle (branco) do mesmo meio de cultura.

Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de micro-organismos.

Os microrganismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em TSB são: 

• Staphylococcus aureus ATCC 6538;
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027;
• Bacillus subtilis ATCC 6633;
• Candida albicans ATCC 10231;
• Aspergillus brasiliensis ATCC 16404.

Após inoculação, as condições de incubação para bactérias são temperatura de 30 à 35ºC por 18-24 horas, para fungos, a temperatura é de 20º a 25ºC por 2-5 dias. As cepas de B. subtilis, C. albicans e A. brasiliensis são usadas para avaliar o TSB preparado para o ensaio de esterilidade.

Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010

Tryptic Soy Agar (TSA)

Indicação de uso

O meio TSA – Tryptic Soy Agar, também conhecido como Soybean-Casein Digest Agar, Agar Caseína Soja ou Ágar Digestão Enzimática de Caseína-Soja é o meio de escolha dos métodos farmacopeicos para o ensaio de Contagem do número total de micro-organismos Mesofílicos (também chamado de Bioburden em alguns laboratórios) em diversos seguimentos, como industria farmacêutica, cosmética, alimentos etc. Também é utilizado para monitoramento ambiental, e embora seja mais indicado para o crescimento de bactérias, tem sido muito usado para detecção de fungos em ambientes controlados, bastando incubar em temperatura ideal para o crescimento de bolores e leveduras. Pode ser utilizado como meio de manutenção de cepas bacterianas e para isolamento de bactérias, para uma identificação posterior.

TSA é usado para o isolamento e cultivo de micro-organismos não fastidiosos e fastidiosos, mas não é o meio de escolha para anaeróbios.

Formulação e Preparo

Fórmula Aproximada Por Litro

• Peptona de caseína pancreática – 15 g
• Farinha de soja obtida por digestão papaínica - 5 g
• Cloreto de Sódio - 5 g
• Agar - 15 g

A combinação de caseína e peptonas de soja em TSA torna o meio altamente nutritivo, fornecendo nitrogênio orgânico, particularmente aminoácidos e peptídios de cadeia mais longa. O cloreto de sódio mantém o equilíbrio osmótico. Agar é o agente solidificante.

O pH final é 7.3 ± 0.2

O preparo do meio deve seguir as instruções do fabricante. Quanto ao tempo de esterilização, este deve estar de acordo com a qualificação do equipamento.

No preparo em laboratório, outros constituintes podem ser acrescentados à preparação deste meio, de modo à adequá-lo para seus diversos usos. Para análises clinicas, é usado sangue de ovelha a 5%. Placas para monitoramento ambiental podem vir acrescidas de inativantes para os princípios ativos do saneantes mais usados para limpeza e sanitização dos ambientes de laboratório e planta de fábrica. Para análises em produtos acabados, recomenda-se a adição de agentes neutralizantes adequados ao tipo de conservante.

Micro-organismos Indicados para o Teste de Grow Promotion

Os compêndios trazem uma lista com os micro-organismos a serem inoculados para o teste de grow promotion (também conhecido como teste de promoção de crescimento ou capacidade nutritiva dos meios de cultura). Outros micro-organismos, como cepas in house podem ser inoculadas também de modo a comprovar a capacidade do meio de recuperar os mesmos. Uma suspensão com não mais do que 100 UFC deve ser inoculada no meio. Para ser considerado aprovado, a Farmacopeia Americana recomenda que o crescimento obtido não deve diferir por um fator maior que 2 do valor calculado para um inóculo. Já a Farmacopeia Brasileira diz que o crescimento obtido que não deve ser inferior a 50% em relação ao inóculo padronizado. Para verificar a esterilidade dos meios de cultura, colocá-los em incubação por, no mínimo, 72 horas, na temperatura adequada. Não deve haver crescimento de micro-organismos.

Os micro-organismos citados pela United States Pharmacopeia e Farmacopeia Brasileira para o teste de Grow Promotion em TSA são: 

• Staphylococcus aureus ATCC 6538;
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027;
• Bacillus subtilis ATCC 6633;
• Candida albicans ATCC 10231;
• Aspergillus brasiliensis ATCC 16404. 

Após inoculação, as condições de incubação para bactérias são temperatura de 30 à 35ºC por 18-24 horas, para Candida albicans 20º a 25ºC por 2-3 dias e para Aspergillus brasiliensis 20º a 25ºC por 5-7 dias ou até esporulação evidente.

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Fontes:

Difco & BBL Manual - Manual of Microbiological Culture Media – Second Edition

United States Pharmacopeia 40ª ed. 2017

Farmacopeia Brasileia 5ª ed. 2010